Registro:
Documento: | Tesis Doctoral |
Disciplina: | biologia; quimica |
Título: | Purificación de la cruzipaína por cromatografía de afinidad : Su aplicación en el estudio del control de calidad del plegamiento de glicoproteínas en Trypanosoma cruzi |
Autor: | Labriola, Carlos Alberto |
Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
Filiación: | Fundación Campomar. Instituto de Investigaciones Bioquímicas
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Publicación en la Web: | 2017-03-01 |
Fecha de defensa: | 1999 |
Fecha en portada: | 1999 |
Grado Obtenido: | Doctorado |
Título Obtenido: | Doctor en Ciencias Químicas |
Director: | Cazzulo, Juan José |
Director Asistente: | Parodi, Armando José |
Idioma: | Español |
Tema: | química/química biológica biología/parasitología
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Formato: | PDF |
Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3162_Labriola |
PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n3162_Labriola.pdf |
Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n3162_Labriola |
Ubicación: | Dep.BIO 003162 |
Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Labriola, Carlos Alberto. (1999). Purificación de la cruzipaína por cromatografía de afinidad : Su aplicación en el estudio del control de calidad del plegamiento de glicoproteínas en Trypanosoma cruzi. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3162_Labriola |
Resumen:
Parte I: Purificación de cisteína proteinasas detrypanosomátidos por cromatografía de afinidad. Trypanosoma rangeli es un trypanosoma de América del sur capaz deinfectar mamíferos pero aparentemente incapaz de causar patología. Tieneuna alta reactividad inmunológica cruzada con Trypanosoma cruzi, elagante de la enfermedad de Chagas. La diferencia principal entre ambosparásitos parece ser la localización de las formas infectivas de T. rangeli enlas glándulas salivales, comparada con la localización rectal de lostrypomastigotes metacíclicos de T. cruzi, y la aparente pérdida de un estadíointracelular en el mamífero, en el caso del primer parásito. El último puntosugiere que algunos o todos de los diferentes factores postulados a estarinvolucrados en el reconocimiento, adherencia a, y penetración dentro de lacélula de mamífero por los trypomastigotes de T. cruzi, podrían estarausentes o fuertemente disminuidos en T. rangeli. Entre un número defactores de virulencia propuestos, la cruzipaína, cisteína proteinasa principalde T. cruzi ha sido descripta como una enzima esencial en distintos puntosdel ciclo biológico del parásito y podría estar directamente involucrada en lapenetración. Por esta razón, decidimos investigar actividades de cisteínaproteinasa en epimastigotes de T. rangeli. Hemos purificado cruzipaína a homogeneidad proteica (de T. cruzi) y unacisteína proteinasa (de T. rangeli) utilizando cromatografía de afinidad,tanto en cistatina-Sepharosa, específica para cisteína proteinasas, como enconcanavalina-A (ConA), específica para glicoproteínas con oligosacáridos dealta manosa, partiendo de extractos crudos de epimastigotes. La últimaenzima se expresa a un nivel de dos órdenes de magnitud menor que lacruzipaína en epimastigotes de T. cruzi. Ambas enzimas tienen masamolecular aparente, idéntica secuencia N-terminal y reacción inmunológicacruzada, pero difieren en la secuencia completa y en algunos parámetroscinéticos. Parte II: Control de calidad de plegamiento de glicoproteínasen Trypanosoma cruzi. Las N-glicoproteínas son al principio glicosiladas con la transferencia de unoligosacárido (Glc3Man9GlcNAc2, en la mayoría de las células) desde underivado de dolicol-P-P a un residuo de Asn en el lúmen del retículoendoplásmico (RE). Los oligosacáridos unidos a proteína son procesados en lamisma localización subcelular por la glucosidasa I (GI) que remueve launidad de glucosa (Glc) mas externa y la glucosidasa II (GII) que remueve lasdos glucosas remanentes. Un proceso adicional en el RE es la reaccióncatalizada por la UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (GT). Esta enzimaagrega una unidad de Glc a oligosacáridos libres de glucosa en glicoproteínasque no presentan su plegamiento terciario correcto. La GII deglucosila losoligosacáridos monoglucosilados generados por la GT. Las glicoproteínasadquiren su estructura terciaria final en el RE. Las glicoproteínas quefracasan en adquirir su plegamiento correcto son retenidas en el RE yposteriormente transportadas al citosol donde son degradadas en elproteasoma. Por otro lado, las moléculas que se pliegan correctamentepueden continuar su tránsito a través del camino secretorio a su destinofinal. Se han descripto en el lúmen del RE, dos chaperones noconvencionales, calnexina (Cnx) y calreticulina (Crt). Se ha demostrado quela interacción de la Cnx/Crt con glicoproteínas monoglucosiladas facilita elplegamiento de las glicoproteínas en células de mamíferos previniendo laagregación y la supresión de uniones disulfuro incorrectas. Mas aún, lainteracción antes mencionada provee uno de los mecanismos por los cualeslas células retienen en el RE glicoproteínas mal plegadas. Las interacción Cnx/Crt con glicoproteínas monoglucosiladas fue considerado por lo tanto,como un control de calidad de plegamiento de glicoproteínas. Este modelo predice que la inhibición de la remoción de la Glc agregada porla GT, retardaría (o aboliría) la salida de las glicoproteínas del RE. Estapredicción no puede ser comprobada, sin embargo, en la mayoría de lascélulas dado que la GII es la responsable de la remoción de ambas unidadesde Glc unidas en α(1,3). Mas aún, los inhibidores conocidos de GII tambiéninhiben GI. La adición de estas drogas a las células lleva a la acumulación deoligosacáridos con dos o tres Glc que no son reconocidos por la Cnx/Crt. La predicción puede ser comprobada en T. cruzi. Este parásito transfiere “invivo” oligosacáridos no glucosilados (Man9GlcNAc2) a los polipéptidosnacientes y, por lo tanto, los oligosacáridos monoglucosilados se forman enellos solamente vía GT. La cruzipaína, una cisteína proteinasa lisosomal de T. cruzi, teniendo tressitios potenciales de N-glicosilación, al menos dos de los cuales estánocupados, se aisló en la forma glucosilada de células crecidas en presencia de 1-deoxinojirimicina (DNJ), un inhibidor de la GI y GII. El oligosacáridopresente en el único sitio de glicosilación del dominio carboxilo-terminal dela cruzipaína se glucosiló en algunas moléculas de enzima pero no en otras,este resultado es consistente con un plegamiento asincrónico de lasglicoproteinas en el RE. A pesar de no afectar la velocidad de crecimientocelular o el metabolismo celular general en incubaciones cortas y largas, la DNJ causó un marcado retraso en el arribo de la cruzipaína a los lisosomas. Este resultado es compatible con el modelo propuesto por el cual lasglicoproteinas monoglucosiladas podrían ser transitoriamente retenidas en el RE por anclas tipo lectinas reconociendo oligosacáridos monoglucosilados. También se encontró que este protozoo expresa una molécula tipo Crt, eltercer componente (además de GT y GII) del control de calidad deplegamiento de glicoproteínas. No se detectó un gen que codifique para Cnx. La Crt recombinante de T. cruzi reconoció especificamente oligosacáridosmonoglucosilados del tipo alta manosa. El agregado de suero anti-Crt aextractos obtenidos de células de un experimento de “pulse-Chase” con [35S]Met más [35S] Cys inmunoprecipitó dos proteínas que fueron identificadascomo Crt y cruzipaína. La última proteína pero no la primera desapareciódurante el período de “chase”. Contrariamente a lo que sucede en células demamíferos, la adición de DNJ promovió la interacción Crt-cruzipaína. Esteresultado es consistente con la vía conocida de N-glicosilación de proteínas yprocesamiento de oligosacáridos que ocurren en T. cruzi y explica el retrasoen el arribo de la cruzipaína a los lisososmas causado por la DNJ. Eltratamiento de los complejos Crt-cruzipaína con endo-β-N-acetilglucosaminidasa H (Endo H) tanto antes como después del agregado delsuero anti-Crt abolió por completo la interacción Crt-cruzipaína. Además, lacruzipaína madura monoglucosilada pero no la no glucosilada aislada de loslisosomas interactuó con la Crt recombinante. Concluimos que la Crt de T.cruzi se une a oligosacáridos monoglucosilados pero no a motivos proteicosen la cruzipaína. Mas aún, las evidencias indican que la GT glucosiló a lacruzipaína en sus últimos estados de plegamiento.
Abstract:
Part I: Purification of cysteine proteinases of Trypanosomatidsby affinity chromatography. Trypanosoma rangeli is a South American trypanosome able to infectmammals, but apparently unable to elicit pathology. lIt has a highimmunological cross-reactivity with Trypanosoma cruzi, the agent of Chagasdisease. The major differences between both parasites seem to be the salivarygland location of the infective forms of T. rangeli, as compared with therectal localization of the metacyclic trypomastigotes of T. cruzi, and theapparent lack of an intracellular stage in the mammal, in the case of theformer parasite. The latter point suggest that some or all of the differentfactors postulated to be involved in recognition, adherence to, andpenetration into the mammalian cell by T. cruzi trypomastigotes might beabsent or strongly diminished in T. rangeli. Among a number of proposedvirulence factors, cruzipain, the major cysteine proteinase of T. cruzi hasbeen implied as an essential enzyme in several points of the biological cycleof the parasite, and may also be directly involved in penetration. For thisreason, we decided to search for cysteine proteinase activities inepimastigotes of T. rangeli. We have purified to protein homogeneity cruzipain (from T. cruzi) and acysteine proteinase (from T. rangeli), using affinity chromatography, both oncystatin-Sepharose, specific for cysteine proteinases, and ConA-Sepharose,specific for high mannose type N-linked glycoproteins, starting from crudeepimastigote extracts. The latter enzyme is expressed at a level at least twoorders of magnitude lower than is cruzipain in T. cruzi epimastigotes. Bothenzymes have similar apparent molecular mass and identical N-terminalsequence, and cross-react immunologicaly, but differ in full sequence and insome kinetic parameters. Part II: The quality control of glycoprotein folding in Trypanosoma cruzi. N-glycoproteins are first glycosylated upon transfer of an oligosaccharide (Glc3Man9GlcNAc2 in most cells) from a dolichol-P-P derivative to Asn residuesin the lumen of the endoplasmic reticulum (ER). Protein-linkedoligosaccharides are then processed in the same subcellular location byglucosidase I (GI) that removes the more external glucose (Glc) unit andglucosidase II (GII) that excises the two remaining Glc. An additional ERprocessing reaction is that catalyzed by the UDP-Glc:glycoproteinglucosyltransferase (GT). This enzyme adds a single Glc unit to Glc-free, highmannose-type oligosaccharides in glycoproteins not displaying their properlyfolded tertiary structures. GII deglucosylates the monoglucosylatedoligosaccharides generated by GT. Glycoproteins acquire their proper tertiarystructure in the ER. Glycoproteins that fail to properly fold are retained inthe ER and further transported to the cytosol where they are degraded in theproteasomes. On the other hand, properly folded species may continue theirtransit through the secretory pathway to their final destinations. Twounconventional chaperones calnexin (Cnx) and calreticulin (Crt), have beendescribed in the ER lumen of mammalian cells. It has been shown thatinteraction of Cnx/Crt with monoglucosylated glycoproteins facilitatesglycoprotein folding in mammalian cells by preventing aggregation andsuppressing formation of non-native disulfide bonds. Moreover, the abovementioned interaction provides one of the mechanisms by which cells retainmisfolded glycoproteins in the ER. The Cnx/Crt interaction withmonoglucosylated glycoproteins has been considered to be, therefore, aquality control of glycoprotein folding. This model predicts that inhibition of removal of the Glc unit added by GTwould delay (or abolish) exit of glycoprotein from the ER. This prediction cannot be tested, however, in most eukaryotic cells as GII is responsible forremoval of both α(1,3) linked Glc units. Moreover, known inhibitors of GIIalso inhibit GI. Addition of those drugs to cells leads to the accumulation ofoligosaccharides having two or three Glc that are not recognized by Cnx/Crt. The prediction can be tested in T. cruzi. This parasite transfers “in vivo”unglucosylated oligosaccharides (Man9GlcNAc2)to nascent polypeptide and,therefore, monoglucosylated oligosaccharides are formed in them only by GT. Cruzipain, a T. cruzi lysosomal cysteine proteinase having three potential N-glycosilationsites, at least two of which are occupied, was isolated in aglucosylated form from cells grown in the presence of the GI and GIIinhibitor 1-deoxynojirimycin (DNJ). The oligosaccharide present at the singleglycosylation site of the carboxy-terminal domain of cruzipain wasglucosylated in some enzyme molecules but not in others, this result beingconsistent with an asyncronous folding of glycoproteins in the ER. In spite ofnot affecting cell growth rate or the cellular general metabolism in short andlong term incubation, DNJ caused a maeked delay in the arrival of cruzipainto lysosomes. This results is compatible with the model proposed by whichmonoglucosylated glycoproteins may be transiently retained in the ER bylectin-like anchors recognizing monoglucosylated oligosaccharides. It wasfound also that this protozoan expresses a Crt-like molecule, the thirdcomponent (in addition to GT and GII) of the quality control of glycoproteinfolding. No Cnx-encoding gene was detected. Recombinant T. cruzi calreticulin specifically recognized freemonoglucosylated high mannose-type oligosaccharides. Addition of anti-Crtserum to extracts obtained from cells pulse-chased with [35S]Metplus [35S]Cysimmunoprecipitated two proteins that were identified as Crt and thelysosomal proteinase cruzipain. The latter but not the former proteindisappeared upon chasing cells. Contrary to what happens in mammaliancells, addition of DNJ promoted Crt-cruzipain interaction. This result isconsistent with the known pathway of protein N-glycosylation andoligosaccharide processing occurring in T. cruzi and explains the delay incruzipain arrival to lysosomes caused by DNJ. A treatment of the Crt-cruzipaincomplexes with endo-β-N-acetylglucosaminidase H (Endo H) eitherbefore or after addition of anti-Crt serum completely disrupted Crt-cruzipaininteraction. In addition, mature monoglucosylated but not unglucosylatedcruzipain isolated from lysosomes was found to interact with recombinant Crt. It was concluded that T. cruzi Crt binds monoglucosylatedoligosaccharides but not the protein moiety of cruzipain. Furthermore,evidence is presented indicating that GT glucosylated cruzipain at its lastfolding stages. Journal of Cell Biology 130, N° 4 (1995) 771-
Citación:
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Labriola, Carlos Alberto. (1999). Purificación de la cruzipaína por cromatografía de afinidad : Su aplicación en el estudio del control de calidad del plegamiento de glicoproteínas en Trypanosoma cruzi. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3162_Labriola
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Labriola, Carlos Alberto. "Purificación de la cruzipaína por cromatografía de afinidad : Su aplicación en el estudio del control de calidad del plegamiento de glicoproteínas en Trypanosoma cruzi". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 1999.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3162_Labriola
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