Participación de los sistemas Notch y Wnt/ß-Catenina en la función y angiogénesis ovárica

Accialini, Paula Lucía

Registro:

Documento:	Tesis Doctoral
Disciplina:	quimica
Título:	Participación de los sistemas Notch y Wnt/ß-Catenina en la función y angiogénesis ovárica
Título alternativo:	Involvement of Notch and Wnt/ß-catenin pathways in ovarian function and angiogenesis
Autor:	Accialini, Paula Lucía
Editor:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Filiación:	Instituto de Biología y Medicina Experimental (IByME). Laboratorio de Fisiología y Biología Tumoral del Ovario
Publicación en la Web:	2019-03-31
Fecha de defensa:	2018-03-19
Fecha en portada:	2018
Grado Obtenido:	Doctorado
Título Obtenido:	Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica
Director:	Tesone, Marta
Director Asistente:	Abramovich, Dalhia Nurit
Consejero:	Calvo, Juan Carlos
Jurado:	Pérez Martínez, Silvina; Cohen, Débora J.; Varone, Cecilia L.
Idioma:	Español
Palabras clave:	CUERPO LUTEO; NOTCH; PROGESTERONA; WNT/SS-CATENINA; ESTEROIDOGENESIS; ANGIOGENESISCORPUS LUTEUM; NOTCH; PROGESTERONE; WNT/SS-CATENIN; TEROIDOGENESIS; ANGIOGENESIS
Formato:	PDF
Handle:	http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6341_Accialini
PDF:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/tesis/tesis_n6341_Accialini.pdf
Registro:	https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/tesis/document/tesis_n6341_Accialini
Ubicación:	Dep.QUI 006341
Derechos de Acceso:	Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Accialini, Paula Lucía. (2018). Participación de los sistemas Notch y Wnt/ß-Catenina en la función y angiogénesis ovárica. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6341_Accialini

Resumen:

El cuerpo lúteo (CL) es una glándula endócrina transitoria esencial para lasupervivencia e implantación del embrión. Es por esto que su formación, función yregresión están estrictamente reguladas a través de diversas vías de señalización. En estatesis se estudió el rol de los sistemas Notch y Wnt/β-catenina sobre el desarrollo yfunción del CL de ratas. También se analizó la interacción de ambas vías con la acciónde la progesterona. El primer capítulo de esta tesis se diseñó con el objetivo de estudiar la acción in vitrodel sistema Notch y su interacción con progesterona en cultivo de cuerpo lúteo de rata. Se utilizaron ratas prepúberes inyectadas de forma subcutánea con eCG y 48 horasdespués con hCG. Cuatro días después, los animales sufrieron eutanasia. Se aislaron los CLs y se cultivaron en presencia de Aminoglutetimida (AG, inhibidor de la síntesis deprogesterona), DAPT (inhibidor del sistema Notch), progesterona, de DAPT enpresencia de progesterona, o vehículo de las drogas (DMSO). Luego de una o 4 horas decultivo, se recolectaron los CLs y los medios condicionados. Se estudió la funcionalidadluteal midiendo la concentración de progesterona en el medio. Se evaluó laparticipación del sistema Notch y de progesterona en cuanto al contenido de proteínaspro- y anti-apoptóticas, regulación de las enzimas esteroidogénicas, contenido de PCNA (marcador de proliferación) y nivel de fosforilación de AKT y ERK. DAPT produjo una disminución de la producción de progesterona. A su vez se observóuna disminución en el contenido luteal de la enzima P450scc. La presencia deprogesterona en el medio de cultivo aumentó los niveles de StAR, efecto que fueimpedido al inhibir la vía de Notch. El cultivo con DAPT produjo un aumento de larelación entre proteínas pro:anti-apoptóticas y un aumento del fragmento activo decaspasa 3. Este aumento en la apoptosis fue revertido con la presencia de progesteronaen el medio de cultivo. Para determinar la proliferación de células del CL, se cuantificóel contenido de PCNA. Progesterona incrementó significativamente los niveles de PCNA, y este aumento fue impedido por DAPT. Además, DAPT disminuyó lafosforilación de AKT, la cual se restituyó con la incubación junto a progesterona. Los resultados de este capítulo muestran por primera vez la existencia de unainteracción entre Notch y progesterona que promueve la función y supervivencia del CL. El segundo capítulo de esta tesis se diseñó con el objetivo de estudiar la implicancia dela vía Wnt/β-catenina en la función del ovario de ratas superovuladas. Se utilizaron ratas prepúberes inyectadas de forma subcutánea con eCG y 48 horasdespués con hCG, día en que los animales fueron operados. A un grupo se le administróbajo la bursa de ambos ovarios un inhibidor específico de la vía Wnt/β-catenina (XAV939), mientras que el grupo control recibió la dosis equivalente del vehículo delinhibidor (DMSO). Lo animales sufrieron eutanasia 24 o 48 horas luego de la cirugía. Se estudió el desarrollo folicular y la formación de CL en ovarios de cada grupoexperimental y se evaluó también la concentración de progesterona sérica. En extractoproteico de CLs se midió el contenido de proteínas pro- y anti-apoptóticas, de enzimasesteroidogénicas y de PCNA. Además, se determinó el grado de fosforilación de lasproteínas AKT y ERK. Por último, se cuantificaron los niveles de VEGF luteal y seestudió el desarrollo vascular del CL mediante marcación con lectina BS-1. La inhibición in vivo de la vía Wnt/β-catenina produjo una disminución en el porcentajede CLs, efecto que estuvo acompañado por la aparición de estructuras quísticas. Laconcentración de progesterona sérica disminuyó en los animales tratados con XAV939,como así también el contenido luteal de la proteína StAR. La administración de XAV939 aumentó el balance entre proteínas pro:anti-apoptóticas, incrementando laapoptosis en células del CL. A su vez, XAV939 disminuyó los niveles de ERKfosforilado y el contenido de PCNA en CL. Además, la inhibición de la vía Wnt/β-catenina disminuyó el porcentaje de área endotelial en CL y redujo el contenido lutealde VEGF. La doble marcación para PCNA y lectina reveló que la mayoría de las célulasproliferativas son las endoteliales. Estos resultados demuestran por primera vez que lavía Wnt/β-catenina está involucrada en el proceso de ovulación y funcionalidad lutealde ratas prepúberes tratadas con gonadotrofinas. El tercer capítulo de esta tesis se diseñó con el objetivo de estudiar la acción in vitro delsistema Wnt/ß-catenina sobre la expresión de miembros del sistema Notch. Se utilizaron ratas prepúberes inyectadas de forma subcutánea con eCG y 48 horasdespués con hCG. Dos días luego de la administración de hCG, los animales sufrieroneutanasia. Se aislaron los CLs y se cultivaron en presencia de ICG-001 o soluciónvehículo (DMSO). El ICG-001 es un inhibidor de la vía de Wnt/β-catenina con unmecanismo de acción distinto al de XAV939. Luego de 12 horas de cultivo, serecolectaron los CLs y los medios condicionados. Se estudió la funcionalidad lutealmidiendo la concentración de progesterona en el medio. En extractos de ARN de CLs seestudió la expresión de miembros del sistema Notch, y en extractos proteicos se midióel contenido de la proteína StAR. ICG-001 disminuyó la producción de progesterona y el contenido de la proteína StAR,reproduciendo el resultado observado con XAV939 en el capítulo II. Además, lainhibición de la vía Wnt/β-catenina produjo un aumento de la expresión génica delreceptor notch1, del ligando jagged1, del efector hes1 y del regulador rbpjκ. Losresultados de este capítulo muestran que, ante la inhibición de Wnt/β-catenina, lascélulas del CL promueven la activación de la vía de Notch, posiblemente comomecanismo compensatorio para recuperar la homeostasis celular. Los resultados de esta tesis demuestran que los sistemas Notch y Wnt/β-catenina estánimplicados en la regulación del desarrollo y función del CL de rata. A su vez, revelan laexistencia de una interacción entre estas vías y la progesterona que promueve lafuncionalidad luteal.

Abstract:

The corpus luteum (CL) is a temporary endocrine organ essential for the survival andimplantation of the embryo. For this reason, the development, function and regressionof the CL are accurately regulated by various signalling pathways. In this thesis, westudied the involvement of Notch and Wnt/β-catenin pathways in the development andfunction of the rat CL. We also analysed their interaction with the progesterone action. The first chapter of this thesis was designed to study the action of Notch pathway on rat CL function, and its interaction with progesterone. Immature Sprague-Dawley female rats (21-23 day-old) were subcutaneously (sc)injected with eCG followed by hCG 48 hours later. The animals were euthanized 4 daysafter hCG administration. CLs were isolated and cultured in the presence of Aminoglutethimide (AG, which is a progesterone synthesis inhibitor), DAPT (which isa Notch pathway inhibitor), progesterone, DAPT in the presence of progesterone, orvehicle solution (DMSO). CLs were collected and the conditioned media were frozen. One or 4 hours after incubation, CL function was studied by measuring progesteroneconcentration in the conditioned medium. Besides, steroidogenic regulators, apoptoticparameters, PCNA content and AKT and ERK phosphorylation levels were measured in CLs protein extracts. DAPT produced a decrease in progesterone production along with a decrease in P450scc protein levels. The presence of progesterone in the culture medium caused anincrease in StAR protein levels, and this effect was blocked by the inhibition of Notchpathway. DAPT produced an increase in pro:anti-apoptotic protein ratio and an increasein the levels of cleaved caspase 3. Both effects were blocked by the presence ofprogesterone in the culture medium. To study the proliferation of the CL cells, PCNAwas measured by Western blot. Progesterone increased PCNA levels and this effect wasimpaired by DAPT. Moreover, DAPT decreased AKT phosphorylation levels, and thiseffect was reversed by the coincubation with progesterone. These results provide the first evidence of a crosstalk between Notch pathway andprogesterone, which promotes the functionality and survival of the CL. The second chapter of this thesis was designed to determine the involvement of Wnt/β-catenin pathway in ovarian function of superovulated rats. Immature female rats were sc injected with eCG followed by hCG 48 hours later. Theday of hCG administration, Wnt/β-catenin inhibitor (XAV939 group) or vehicle (DMSO, control group) was administered into the bursa of both ovaries. Animals wereeuthanized 24 or 48 hours after XAV939 or vehicle administration. Follicle and CLdevelopment were analyzed in ovarian sections from each group and serumprogesterone concentration was measured. The content of pro- and anti-apoptoticproteins and steroidogenic regulators were determined in CL protein extracts. Inaddition, the proliferation marker PCNA, and AKT and ERK phosphorylation wasanalyzed. Finally, luteal VEGF abundance and vascular development through lectin- BS1 staining were determined. In vivo Wnt/β-catenin inhibition produced a decrease in the percentage of CLs. Thisresult correlated with the appearance of cystic structures. Besides, circulatingprogesterone concentration decreased, related to a reduction in StAR protein content in CL. XAV939 administration increased pro:anti-apoptotic protein ratio, which enhancedapoptosis of the CL cells. Wnt/β-catenin inhibition decreased luteal PCNA proteinlevels and ERK phosphorylation. In addition, the percentage of endothelial cell area inthe CLs and the abundance of luteal VEGF were diminished after administration of XAV939. The double staining for PCNA and lectin revealed that the proliferative cellsare mainly endothelial cells. These results describe for the first time that Wnt/β-cateninsystem regulates ovulation and CL function in gonadotropin–treated rats. The third chapter of this thesis was designed to study the in vitro action of Wnt/β-catenin pathway on Notch members expression. Immature female rats were sc injected with eCG followed by hCG 48 hours later. Theanimals were euthanized 2 days after hCG administration. CLs were isolated andcultured in the presence of ICG-001, a Wnt/β-catenin inhibitor with a differentmechanism of action than XAV939, or vehicle solution (DMSO). 12 hours afterincubation, CLs were collected and the conditioned media were frozen. The expressionof Notch family members was studied and StAR protein levels were measured in CLprotein extracts. Besides, CL function was studied measuring progesteroneconcentration in the conditioned medium. ICG-001 produced a decrease in luteal progesterone production and StAR proteinlevels, repeating the effect observed in chapter II with XAV939. Besides, Wnt/β-catenininhibition increased the expression of notch1, jagged1, hes1 and rbpjκ. These resultsshow that CL cells upregulate Notch pathway after Wnt/β-catenin inhibition,presumably as a compensatory mechanism to recover cellular homeostasis. The results of this thesis demonstrate that Notch and Wnt/β-catenin pathways regulatethe development and function of the rat CL. Besides, they show an interaction betweenthese pathways and progesterone that promotes CL functionality.

Citación:

---------- APA ----------

Accialini, Paula Lucía. (2018). Participación de los sistemas Notch y Wnt/ß-Catenina en la función y angiogénesis ovárica. (Tesis Doctoral. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6341_Accialini

---------- CHICAGO ----------

Accialini, Paula Lucía. "Participación de los sistemas Notch y Wnt/ß-Catenina en la función y angiogénesis ovárica". Tesis Doctoral, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2018.https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6341_Accialini

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