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Ver el documento (formato PDF)   Hagelin, Karin.  "Estudios estructurales y cinéticos de variantes de la fructosa-1,6- bisfosfatasa de los cloroplastos de trigo generadas en Escherichia coli"  (1996)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
La Fructosa-1,6-bisfosfatasa de los cloroplastos (CFBPasa) de las plantas superiores es un homotetrámero de peso molecular c.a 160000 que cataliza la siguiente reacción: fructosa 1,6-bisfosfato + H2O----> fructosa 6-fosfato + Pi Mg2+ (o Mn2+) La actividad CFBPasa es modulada por la luz, tal como ocurre con otras enzimas regulatorias del cloroplasto. La actividad de la enzima aumenta luego de la transición oscuridad-luz debido a que ocurre (a) un aumento del pH y de la concentración de Mg2+ en el estroma del cloroplasto, (b) la modificación de otros metabolitos y iones del cloroplasto y (c) la reducción de grupos -S-S- de la enzima. La influencia de la luz se debe al efecto del Sistema de Transporte de Electrones mediado por el Sistema Ferredoxina-Tiorredoxina. In vitro, la actividad de la CFBPasa es modulada por componentes tanto fisiológicos (tiorredoxina) como no fisiológicos (cosolventes, aniones caotrópicos, alta presión). Los cambios conformacionales inducidos por estos moduladores son los responsables del aumento de su actividad específica. A fin de analizar las características cinéticas y estructurales de la enzima, el gen de la CFBPasa de los cloroplastos de trigo fue subclonado en el plásmido pGEX-1. La expresión del gen de la proteína de fusión conteniendo a la Glutation-S-transferasa en su extremo N-terminal y a la CFBPasa de trigo en el C-terminal produjo los cuerpos de inclusión. En consecuencia, la CFBPasa particionó en la fracción insoluble del lisado bacteriano. Con esta suspensión fue analizado el proceso de recuperación de las propiedades funcionales de la CFBPasa mediante técnicas de desnaturalización y resolubilización de proteínas. Además se estudió el efecto de moduladores -fisiológicos y no fisiológicos- y de anticuerpos sobre la reconstitución de las actividades CFBPasa como Glutation-S-transferasa en la proteína quimérica. En contraste con las CFBPasas homotetraméricas obtenidas de otras fuentes, la capacidad catalítica residía en un dímero. A fin de caracterizar a la enzima de cloroplastos y comparar su comportamiento con el de la CFBPasa contenida en la proteína de fusión, la secuencia nucleotídica que codifica para la CFBPasa de trigo fue clonada y expresada en otro vector: el plásmido pET-22. Este plásmido condujo a la obtención de la enzima libre del fragmento GST, en la fracción soluble del lidado bacteriano. A partir del mismo, la CFBPasa fue purificada a homogeneidad y caracterizada estructural y cinéticamente. Al igual que las contraparte de otros orígenes, la CFBPasa de trigo era un homotetrámero activable por reductores (ditiotreitol) y moduladores fisiológicos (tiorredoxina) y no-fisiológicos (perturbantes proteicos). De particular interés en estos estudios fue que la ausencia de 20 aminoácidos de la región N-terminal de la CFBPasa no afectara la capacidad catalítica de la enzima. De manera que una región altamente variable en las FBPasas, cloroplásticas y no cloroplásticas, no tendría participación en el mecanismo catalítico.

Abstract:
In higher plants chloroplasts, a homotetrameric enzyme (MW 160000), fructose-1,6-bisphosphatase (CFBPase) catalyzes the cleavage of fructose 1,6-bisphosphate to fructose 6-phosphate and inorganic phosphate. Like other regulatory steps in this organelle, the striking feature of CFBPase is the modulation of activity by the concerted action of stromal metabolites and the light-stimulated Ferredoxin-Tiorredoxin System. In vitro, the enzyme activity is activated by physiological (thioredoxin) and non-physiological (cosolvents, caotropic anions and high preassure) modulators. Hence the modification of intramolecular non-covalent interaction contribute to enhance the reductive activation of CFBPase. In order to determine the kinetic and structural characteristics of the enzyme, the cDNA encoding wheat CFBPase was cloned in the plasmid pGEX-1. The expressed polipeptide comprised the chloroplast enzyme bound to the C-terminus of the Glutation-S-transferase was purified by affinity chromatography. Given that most of this novel protein accumulated in the particulate fraction of the lysate in the form of Inclusion Bodies, the recovery of functionality was essayed. After the insoluble material was resuspended under different conditions, the effect of physiological and non-physiological compounds as well as antibodies were analized on the recovery of CFBPase and Glutation-S-transferase catalytic activity. At variance with homotetrameric CFBPases from other sources, the catalytic capacity of the chimeric enzyme resided in a dimer. In order to evaluate the alterations that the Glutation-S-transferase moiety introduced on the enzyme activity and the formation of Inclusion Bodies, the cDNA that encodes the CFBPase was inserted in the plasmid pET-22. The homotetrameric, soluble and active enzyme was subsequently characterized. Like counterparts from other sources, wheat CFBPase is activable by reductants (dithiothreitol) and physiological (thioredoxin) and non-physiological (protein perturbants) modulators. Interestingly, the absence of 20 aminoacid residues in the N-terminal region does not influence the catalytic activity.

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Registro:
Título : Estudios estructurales y cinéticos de variantes de la fructosa-1,6- bisfosfatasa de los cloroplastos de trigo generadas en Escherichia coli    
Autor : Hagelin, Karin
Director : Wolosiuk, Ricardo Alejandro
Consejero : Krisman, Clara R.
Año : 1996
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Instituto de Investigaciones Bioquímicas "Fundación Campomar"
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Químicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_2905_Hagelin
Idioma : Español
Area Temática : Química / Química Biológica
Biología / Agrobiotecnología
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