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Ver el documento (formato PDF)   Heuck, Alejandro Pablo.  "Estudio del intercambio tiol/disulfuro en las proteínas: Caracterización y análisis de la Protein Disulfuro Isomerasa de colza (Brassica napus)"  (1997)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
La modificación de los enlaces disulfuro en las proteínas (escisión, formación e isomerización) es asistida por una creciente familia de proteínas denominadas protein disulfuro oxidoreductasas (PDOR). El mecanismo de acción de estas enzimas se basa en la rápida velocidad con la cual los residuos cisteína de su sitio activo (-Cys-X-Y-Cys-) llevan a cabo los intercambios tiol-disulfuro con los grupos sulfhidrilo o enlaces disulfuro de las proteínas sustrato. En el presente trabajo se desarrolló un novedoso procedimiento para determinar la actividad de las PDORs (Capítulo 1) y se purificó a homogeneidad y se caracterizó tanto estructural, como cinéticamente, la Protein Disulfuro Isomerasa (PDI) de colza (Brassica napus) (Capítulo 2). El método desarrollado para la medición continua de la actividad de las PDORs se basa en la escisión de los enlaces disulfuro de la insulina derivatizada en sus extremos amino terminales con una sonda fluorescente (fluoresceína). La velocidad del incremento en la fluorescencia de la "di Insulina-fluoresceintiocarbamilada" (di Ins-FTC) es lo suficientemente sensible para estimar concentraciones de Tiorredoxina (Trx) de E. coli desde 5 nM hasta 500 nM. Además, el ensayo permite estudiar, empleando reductores no-fisiolólogicos (DTT), el efecto del pH sobre la actividad de estas enzimas sin la interferencia de enzimas accesorias (e.g. NADP-Trx-reductasa). Utilizando este ensayo, se purificó por primera vez, una PDI de semillas de una planta dicotiledónea. Los estudios estructurales revelaron que la PDI de colza es una glicoproteína homodimérica (57 kDa la subunidad) sustituida con un solo oligosacárido del tipo alta manosa. La PDI es estable a la desnaturalización térmica, y la presencia del oligosacárido no alteraría su estabilidad. Sin embargo, la remoción del oligosacárido disminuyó un 60% la actividad reductasa de la PDI. La PDI cataliza tanto la formación, la escisión como la isomerización de los enlaces disulfuro en varias proteínas sustrato. Dos factores son fundamentales en estas reacciones de intercambio tiol-disulfuro: a) el pH y b) el potencial redox del medio. El empleo de la di Ins-FTC como sustrato para medir la actividad reductasa de la PDI y de la Trx, permitió determinar que a pesar de compartir un sitio activo característico y una similitud estructural, ambas enzimas poseen pH óptimos distintos. La Trx cataliza esta reacción a pH neutro o ligeramente alcalino, mientras que la PDI lo hace más eficientemente a pH levemente ácido. Sin embargo, cuando se analizó la efectividad de la PDI en la catálisis de la formación y de la isomerización de las cistinas, la mayor eficiencia se obtuvo a pH levemente alcalinos. Por otra parte, a potenciales redox equivalentes a los que existirían dentro del retículo endoplásmico, la PDI acelera tanto la formación como la isomerización de los enlaces disulfuro. Pero a potenciales más reductores, estas actividades disminuyen y aumenta la capacidad para escindir estos enlaces. Estos estudios sugieren que tanto el pH intracelular, como los niveles de GSH reducido y oxidado (potencial redox) pueden modular la tendencia a la formación o a la escisión de los enlaces disulfuros cuando la PDI es el catalizador. Finalmente, la PDI de colza fue efectiva en la reducción de los enlaces disulfuro de una proteína de reserva presente en la semilla de colza: la napina. Estos resultados en conjunto, sugieren que la PDI podría proveer una vía alternativa para la reducción de varias proteínas presentes en la semilla, además de la ya propuesta para la Trx-h, en los eventos tempranos de la germinación.

Abstract:
The modification of disulfide bonds in proteins (cleavage, formation, and isomerization) is assisted by a growing protein family named protein disulfide oxidoreductases (PDOR). The action mechanism relies on the fast rate of the thiol-disulfide exchange reaction between cysteines of the active site (-Cys-X-Y-Cys-) and the thiol groups or disulfide bonds of the protein target. The present work reports a novel assay for the measurement of the PDOR activity (Chapter 1) and the purification of Protein Disulfide Isomerase (PDI) to near homogeneity, as well as the characterization of kinetic and structural properties (Chapter 2). The method for the continuous assay of the PDOR activity is based on the cleavage of the disulfide bonds of insulin molecule, in which both N-terminal amino groups are chemically modified with a fluorescent probe (fluorescein). The rate of fluorescence increment of di-fluoresceinthiocarbamyl-insulin (di FTC-Ins) is sensitive enough for the estimation of E. coli thioredoxin (Trx) concentrations from 5 nM to 500 nM. Moreover, this assay allows the analysis of the pH effect on the activity of PDORs without the interference of accessory enzymes (e.g. NADP-Trx-reductase). Using this assay, a PDI was purified from Brassica napus germinating seeds. The structural studies showed that this PDI was an homodimeric glycoprotein (subunit of 57 kDa), containing only one high mannose type oligosaccharide. Although the oligosaccharide was not responsible for the unusual resistance of PDI to thermal denaturation, cleavage of the carbohydrate moiety reduced 60% the activity of the enzyme. PDI catalyzed the formation, the cleavage, and the isomerization of disulfide bonds in a variety of target proteins. Two factors were crucial in this thiol-disulfide exchange reactions: a) the pH and b) the redox potential of the milieu. The use of di FTC-Ins as substrate for the reductase activity of PDI and Trx, unveiled that these enzymes have different pH optimum. Whereas Trx catalyzed this reaction at neutral or slightly alkaline pH, PDI was more effective at a slightly acidic pH. However, when the effectiveness of PDI in the catalysis of the formation or isomerization of cystines was assayed, the greatest efficiency was obtained at slightly alkaline pH. At redox potentials similar to that prevailing in the endoplasmic reticulum, PDI catalyzed the formation as well as the isomerization of disulfide bonds. But at more reducing conditions, these activities decreased and the capacity to cleave disulfide bonds increased. These studies suggested that the intracellular pH, as well as the levels of reduced GSH and GSSG (redox potential) can modulate the formation or the cleavage tendency of the disulfide bonds when PDI was the catalyst. Finally, PDI was also effective in the cleavage of the disulfide bonds of a B. napus storage protein: napin. Taking together, these results suggested that, like Trx-h on the early events in the seed germination, PDI could provide an alternative mechanism for the reduction of important seed proteins.

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Registro:
Título : Estudio del intercambio tiol/disulfuro en las proteínas: Caracterización y análisis de la Protein Disulfuro Isomerasa de colza (Brassica napus)     =    Studies on the thiol/disulfide exchange reaction in proteins: Characterization and analysis of Brassica napus Protein Disulfide Isomerase
Autor : Heuck, Alejandro Pablo
Director : Wolosiuk, Ricardo Alejandro
Jurados : Barañao, L.  ; Parodi, A.  ; Delfino, J.
Año : 1997
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Intituto de Investigaciones Bioquímicas
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Químicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_2936_Heuck
Idioma : Español
Area Temática : Química / Química Biológica
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