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Ver el documento (formato PDF)   Matrajt, Mariana Laura.  "Estudio de la organización genómica de elementos de ADN de Taxoplasma gondii y su aplicación al diagnóstico directo de la toxoplasmosis humana"  (1997)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
Toxoplasma gondii es uno de los parásitos protozoarios más ampliamente distribuidos a nivel mundial, y usualmente causa una enfermedad asintomática en los humanos. Sin embargo, la reactivación de la infección crónica en pacientes inmunocomprometidos, y la toxoplasmosis congénita de una infección primaria adquirida durante el embarazo, presentan cuadros clínicos muy severos e incluso puede causar la muerte del paciente. Además, debido a que T. gondii causa mortalidad de los neonatos en ovejas, también representa una causa importante de pérdida económica en las granjas. En este trabajo dos familias de ADN repetitivas de T. gondii fueron caracterizadas. ABGTg7 (721 bp) presenta dos monómeros repetidos completos y 55 nt de un tercero, mostrando una disposición de tandems directos cuya unidad repetida es de aproximadamente 340 bp. ABGTg8 (1002 bp) contiene dos elementos repetidos distintos: uno denominado ABGTg8.2 y un elemento ABGTg7. ABGTg7 y ABGTg8.2 muestran patrones de hibridación muy similares en Southern-blots de ADN de T. gondii digerido con distintas endonucleasas de restricción, sugiriendo que ambos elementos principalmente se encuentran en la misma estructura repetitiva en tandem en el genoma. Análisis de PFGE mostraron que estos elementos repetidos se encuentran en al menos tres de los 4 cromosomas más grandes de T. gondii. Ensayos de sensibilidad a la endonucleasa Bal 31 indicaron que se encuentran localizados cerca de los telómeros de los cromosomas así como también en otras regiones de los mismos. Cinco fagos lambda recombinantes genómicos fueron aislados y dos clusters diferentes completos de la estructura repetitiva fueron analizados. Ambos clusters contienen uno de sus extremos conservados con un fragmento de 4.4 Kbp donde se halla ubicado ABGTg8.2, ligado a numerosos fragmentos Sal I conteniendo todos al menos una copia de los monómeros de ABGTg7. Dentro de estos clusters ambos elementos repetidos forman parte de una estructura compleja en tandem, donde los monómeros de ABGTg7 se encuentran dispuestos tanto como tandems directos como flanqueados por otros elementos repetitivos sin o con baja homología entre ellos. Esta estructura repetitiva en tandem cumple los requerimientos asignados al ADN satelital. Por otra parte, se evaluó el uso potencial de la secuencia ABGTg7 para el diagnóstico de la toxoplasmosis humana. Se realizaron ensayos de hibridación mediante la técnica de Dot-blot en muestras de sangre de pacientes con toxoplasmosis cerebral (CT), linfoadenopatía toxoplásmica (ATL) y toxoplasmosis diseminada en pacientes trasplantados (TR). Se estudió un total de 84 individuos. Se encontraron señales positivas por Dot-blot en 12 (66.7%) de 18 casos con CT confirmada, 9 (52.9%) de 17 casos con ATL y 2 (66.7%) de 3 casos con TR con toxoplasmosis. En paralelo se realizaron ensayos de PCR en los pacientes con ATL, resultando en la detección de ADN de T. gondii en 10 casos (58.8%). Un estudio comparativo entre el Dot-blot y la PCR fue realizado también en ratones experimentalmente infectados con taquizoitos, el cual arrojó resultados similares: 60% y 70% de valores positivos respectivamente. Finalmente la suma de valores positivos obtenidos con ambos tests (Dot-blot más PCR) incrementó el número de sospechas de infección toxoplásmica en los pacientes con ATL a un 76.4% de casos. Por otro lado, si se consideran los resultados positivos obtenidos simultáneamente por las dos técnicas, se confirmó el resultado en el 35.2% de los casos. Estos resultados indican que la sonda repetitiva ABGTg7 es un recurso adicional útil para el diagnóstico de la toxoplasmosis humana. Finalmente, teniendo en cuenta los resultados obtenidos en los estudios básicos sobre la organización genómica de estos elementos repetidos, se desarrolló un ensayo de PCR basado en la secuencia ABGTg7 con el objeto de ser evaluado como herramienta diagnóstica.

Abstract:
Toxoplasma gondii is one of the most widely distributed protozoan parasites in the world, and usually causes asymptomatic disease in humans. However, reactivation of chronic infection in immunocompromised patients, and congenital toxoplasmosis resulting from primary infection acquired during pregnancy, present severe and life threatening clinical events. In addition, since T. gondii causes neonatal mortality in sheep, it also represents a major cause of economic loss in the farming industry. In the present work two T. gondii repetitive DNA elements were characterized. ABGTg7 (721 bp) exhibited two complete repeat monomers and 55 nt of a third one, showing an array of direct tandems with a repeat monomer of about 340 bp long. ABGTg8 (1,002 bp) contains two different repetitive DNA elements: one named ABGTg8.2 and an ABGTg7-like element. ABGTg7 and ABGTg8.2, displayed very similar hybridization patterns in Southern blots of T. gondii DNA digested with different restriction endonucleases suggesting that both repeats are mainly present in the same tandem repeat structure. PFGE analysis showed that these repeats are present in at least three of the four largest chromosomes of T. gondii. Bal 31 sensitivity assays indicated that these elements are located near the telomeres and along other regions too. Five genomic lambda phages were isolated and two different completed clusters of the repeated structure were analyzed. Both clusters have a conserved border of about 4.4 Kbp where ABGTg8.2 is situated, linked to several Sal I fragments, all containing at least one copy of an ABGTg7 monomer. Inside these clusters both repeats are members of a more complex tandem structure where ABGTg7-like monomers can be arranged either as direct tandems or flanked by other repeats which have no or low homology among them. This novel tandemly repeated structure meets the requirements assigned for satellital DNA. Besides, the potential diagnostic use of ABGTg7 is reported. A Dot-blot hybridization assay in blood samples for diagnosis of cerebral toxoplasmosis (CT), acute toxoplasmic lymphadenopathy (ATL) and disseminated toxoplasmosis in transplant recipients (TR), was applied. A total of 84 individuals were studied. We found positive hybridization signals in 12 (66.7%) out of 18 cases of confirmed CT, 9 (52.9%) out of 17 of ATL and 2 (66.7%) out of 3 of TR. PCR assays were performed in parallel in patients with ATL resulting in T. gondii DNA detection of lO cases (58.8%). A comparative study between Dot-blot and PCR assays performed in blood of mice that had been experimentally infected with tachyzoites gave similar results: 60% and 70% of positives respectively. Finally the sum of positive values obtained with both DNA tests (Dot-blot plus PCR) increased the number of patients with suspected toxoplasmic infection in ATL patients, up to 76.4%. On the other hand, positive values obtained simultaneously by both tests, allow to confirm the results in 35.2% of the cases. These results demonstrate that T. gondii ABGTg7 repetitive DNA element is an additional useful resource for diagnosing Toxoplasma parasitemia. Finally, taking into account the genome organization basic studies of the repetitive elements, a PCR based on ABGTg7 sequence was developed in order to be evaluated as a diagnostic tool.

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Registro:
Título : Estudio de la organización genómica de elementos de ADN de Taxoplasma gondii y su aplicación al diagnóstico directo de la toxoplasmosis humana    
Autor : Matrajt, Mariana Laura
Director : Garberi, Juan C.
Director Asistente : Angel, Sergio
Año : 1997
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud "Dr. Carlos G. Malbrán" (ANLIS). Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas (INEI). Departamento de Parasitología
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_2982_Matrajt
Idioma : Español
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