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Ver el documento (formato PDF)   Ladeda, Virginia Edith.  "Expresión de CD44 en tumores murinos y humanos y su relación con el proceso metastásico"  (1998)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
CD44, receptor del acido hialurónico, es una glicoproteína de membrana con un dominio extracelular altamente glicosilado, una porción transmembrana y una cola citoplasmática que interactúa con el citoesqueleto. Originalmente fue descripta como receptor “homing” en células linfocitarias, pero luego se vio que también se expresa en otros tipos celulares. Existen múltiples formas de esta molécula, llamadas variantes, que se generan por splicing alternativo de 10 exones. La forma mas abundante es la llamada estándar ó hemopoyética (CD44s/ H), que carece de los diez exones alternativos y se expresa predominantemente en células hemopoyéticas y mesenquimaticas. Su peso molecular es de 80-90 kDa. Sus principales funciones son participar en la activación de linfocitos y en la adhesión y migración celular. Las formas variantes tienen un peso molecular de 120-150 kDa y se expresan con predominio en tejidos epiteliales. Las funciones precisas de estas isoformas aún no estan claras. En 1991, Gunthert y col., demostraron que la ísoforma v6 confería capacidad metastasica al ser transfectada en células tumorales no metastásicas de rata. Como consecuencia de este hallazgo ha surgido un gran interés por el estudio de CD44 en otros modelos tumorales. En el desarrollo de este plan de Tesis, hemos estudiado la función, expresión y distribución de CD44 en una línea celular tumoral mamaria murina, F3II, altamente invasiva y metastasica. El estudio de la expresión de CD44 en cortes histológicos de tumores F3II, mostró una alta expresión de esta molécula asociada al crecimiento subcutaneo de los mismos, mientras que dicha expresión fue prácticamente nula en tumores F3II crecidos en forma peritoneal. El analisis de la expresión de CD44, por Western blot e inmunohistoquímica, en cultivos de células tumorales FSII y normales NMuMG, mostró que las monocapas de células FSII expresan mayores niveles que las células normales. En ambas líneas se pudo detectar, por Western blot, una banda principal de 80 kDa, correspondiente a CD44s. También se observó la presencia de bandas de mayor peso molecular, que podrian corresponder a la expresión de variantes de CD44, aunque dicha expresión fue menos evidente en las células NMuMG. Mediante el uso de un anticuerpo monoclonal específico antíCD44 (KM201), hemos demostrado que los procesos de adhesión y spreadíng dc células FSII pueden ser inhibidos en forma significativa. El análisis de la expresión de CD44, por inmunocitoquímica durante el spreading, mostró que esta molécula se distribuye en forma contínua (no punctata) sobre la membrana plasmática, particularmente en los bordes anteriores o de avance y en la zona perinuclear de la membrana plasmática. CD44 no fue detectado en estructuras como filopodios o lamelipodios, pero sí entre dichas estructuras. Las células totalmente extendidas sobre el sustrato, presentaron una significativa disminución de la tinción de CD44 sobre la membrana plasmática, comparado con los estadios iniciales del spreading. Este descenso en la expresión a lo largo del spreading fue confirmado por Western Blot. En ensayos de migración e invasión de células F3II en cámaras Transwell, demostramos que el anticuerpo anti-CD44, fue también capaz de inhibir en forma significativa ambos procesos. Además, el tratamiento de células FSII con anti-CD44 conjuntamente con anti-uPA, la inhibición de la migración se incrementó en un 90%, sugiriendo una acción sinergíca entre CD44 y uPA en favor de la migración de estas células tumorales. Además de la asociación funcional entre CD44 y el uPA en el en el proceso de migración, los resultados de ensayos de inmunoprecipitación con anticuerpos específicos, indicaron que el receptor CD44 estaría físicamente asociado con el uPA, sugiriendo la participación conjunta de ambas moléculas en algunas etapas de la cascada metastasica de células tumorales mamarias murinas. En conjunto estos resultados demuestran que, en la línea celular tumoral F3II, CD44 cumple un rol activo en eventos críticos que tienen lugar durante la cascada metastásica, como la adhesión, spreading, migración e invasión celular. Mediante un enfoque farmacológico, se estudiaron las vías de señalización que participarían en la regulación de la expresión de CD44 en células FSII. El tratamiento de células F3II con PMA, activador de PKC, o ácido fosfatídico, producto de la degradación de fosfatídilcolina dependiente de PLD, aumentaron en forma significativa la expresión de CD44. Cuando los cultivos fueron tratados con H7, inhibidor específico de PKC,o con propranolol, inhibidor de la conversión de acido fosfatídico a DAG,se observó una sensible disminución de la expresión de CD44. Los resultados de estos experimentos sugieren la participación de PKC y PLD en las vias de señales que regulan la expresión de este receptor. Los tumores cerebrales raramente metastatizan pero son muy invasivos a nivel local. Dado que el AH es un componente abundante de la matriz extracelular del sistema nervioso central y que CD44 participa en su degradación, la sobreexpresión de este receptor podría facilitar el proceso invasivo de estos tumores. En un trabajo colaborativo con los Servicios de Oncología y Patología del Hospital Italiano, hemos analizado la expresión de CD44 en 57 tumores de cerebro (14 astrocitomas de bajo grado, 13 astrocitomas anaplásicos, 22 glioblastomas multiformes, 5 ependimomas y 3 meduloblastomas). Cuando se analizaron los glioblastomas de distintos estadios, se observó que la sobreexpresión de CD44s se correlaciona en forma lineal con el grado de agresividad de estos tumores (Clasificación de Burger). En cambio, el mismo analisis en ependimomas, tumores poco agresivos, mostró una alta expresión de CD44s, mientras que, en meduloblastomas, tumores altamente agresivos, la expresión de esta molécula, fue casi nula. No se detectó expresión de variantes de CD44 en ninguno de los tumores estudiados. Nuestros resultados sugieren que la sobreexpresión de CD44s podria ser de importancia durante el desarrollo de tumores humanos de origen neuroglial.

Abstract:
CD44, the receptor of hyaluronan acid, is a transmembrane glycoprotein, which has an extracellular domain, a transmembrane portion, and a cytoplasmic tail which is connected to the cytoskeleton. CD44 was originally described as the lymphocyte “homing receptor” to lymph nodes endothelium. A large number of isoforms are generated by alternative splicing of up to IO variant exons. Further diversity is created by variable side chain glycosilation. The most abundant form is the so called standard or hematopoetic form, CD44s/H, expressed predominantly in hematopoetic and mesenchymal cells. CD44s lacks the variant exons and has a molecular weight of 80-90 kD. Its multiple functions include lymphocyte activation, cell adhesion and migration. The variant forms range from 120 to 250 kD and are expressed predominantly in epithelial tissues. The precise functions of these isoforms are not clear at present. A considerable amount of interest in this molecule was generated by the finding reported by Gunthert et al (1991), that a particular isoform (v6), when transfected into non metastatic rat pancreatic carcinoma cells, conferred metastatic capability. This was followed by a series of papers indicating increased expression of CD44s and variants in other tumor models. In this Thesis project, we have studied the function, expression and distribution of CD44 in the highly invasive and metastatic murine mammary tumor cell line, F3II. We detected a high CD44 expression on F311subcutaneous tumors, while the expression was almost nule when the tumor grew intraperitoneally. Confluent monolayers of normal murine mammary cells (NMuMG) and F311tumor cells were assayed for their capacity to express CD44 by Western blot and immunohystochemistry. F3II cells were found to express significantly higher levels of CD44 than NMuMG. The Western blot analysis showed a main specific band of 80 kDa on both cell lines, corresponding to CD44s, and minor bands of higher molecular weight suggesting the expression of CD44 variants. A mAb anti-CD44 (KM201) dramatically blocked F3II cell adhesion and spreading. Immunocytochemistry of spreading cells revealed that CD44 distributed in bands on the cell surface, particularly in the tip of leading edges and in the perinuclear zones of the cell membrane. CD44 antigen was never detected in filopodia or lamellipodia but was detected as strong interlamellar bands. CD44 staining never showed a distribution compatible with association to focal adhesion-like structures. Fully spread cells showed remarkably less CD44 staining compared to cells in early stages of spreading. This decrease observed by ICCstudies, correlated with a reduced expression of CD44, as detected by Western blot. KM201 mAb significantly inhibited F3II cell migration and invasion in Transwell Chambers. When F3II cells migration was assayed in the presence of both anti-CD44 and anti-uPA antibodies, the inhibition on migration was dramatically enhanced (90% inhibition). This result suggest a sinergistic cooperation between CD44 and uPA during migration of F3II cells. In addition to the functional cooperation between CD44 and uPA during cell migration, we demonstrated by immunoprecipitation with specific antibodies, a physical link between both molecules on F3II cells. These results may indicate that the close proximity of CD44 and uPA may be important for the functional synergy during the migration process of murine mammary tumor cells. Taken together, these results demonstrate that CD44 plays an important role during F3II cells adhesion, spreading, migration and invasion, all of them critical events during tumor metastasis. We used a pharmacologycal approach to study the signal pathways regulating CD44 expression in F3II cells. Treatment of F3II cells with PMA, a PKC activator, or phosphatidic acid, the product of PLD dependent phosphatidilcholine degradation, significantly enhanced CD44 expression. When F3II cells monolayers were treated with H7, a specific PKC inhibitor, or propranolol, which inhibits phosphatidic acid convertion to DAG, it was observed a dramatic decrease of CD44 antigen levels. These results suggest the involvement of PKC and PLD pathways in the regulation of CD44 expression. Primary brain tumors are characterized by their highly invasive behaviour, although they seldom metastasize to distant organs. HA, a main component of the extracellular matrix in the central nervous system, may be substrate for tumor cell invasion through CD44. In a collaborative study with the “Hospital Italiano”, we have analyzed CD44 expression on 57 human brain tumor biopsies (14 low grade astrocytomas, 13 anaplastic astrocytomas, 22 glioblastomas multiforme, 5 ependymomas and 3 medulloblastomas). In the astrocytomas group we found that overexpression of CD44s correlates with tumor aggresiveness (upon Burger grade). In contrast, in ependymomas, less aggressive tumors, CD44s expression was high, while CD44s expression was almost negative in medulloblastomas, highly aggressive tumors. No CD44 variants expression was detected in any of the samples analyzed. Our results suggest that overexpression of CD44s could be important during the development of human astrocytomas.

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Registro:
Título : Expresión de CD44 en tumores murinos y humanos y su relación con el proceso metastásico     =    CD44 expression in murine and human tumors, and its relationship with the metastatic process
Autor : Ladeda, Virginia Edith
Director : Bal de Kier Joffé, Elisa
Año : 1998
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Instituto de Oncología "A.H.Roffo"
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3005_Ladeda
Idioma : Español
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