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Ver el documento (formato PDF)   Noriega, Guillermo Osvaldo.  "Estudios sobre la porfobiblinógeno-deaminasa de hígado y riñón de rata"  (1998)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
La porfobilinógeno-deaminasa (PBG-D) cataliza la condensación de cuatro moléculas de porfobilinógeno (PBG) para formar el hidroximetilbilano, el cual en presencia de la enzima isomerasa, origina el uroporfirinógeno m, precursor fisiológico en la síntesis de hemos, clorofilas y corrinas. Dado que bajo ciertas condiciones, la PBG-D podría actuar como segundo sitio de regulación, se resolvió estudiar la PBG-D de hígado y de riñón de rata, con un enfoque cinético. Se purificaron ambas enzimas empleando las siguientes técnicas: fraccionamiento con sulfato de amonio, filtración molecular (Sephadex G-lOO), intercambio aniónico (Q-Sepharosa) y cromatografla de afinidad (Blue Sepharosa). La purificación a homogeneidad de la enzima renal se logró mediante una electroforesis preparativa, que mostró una sola banda proteica con actividad, confirmada a través de Western blots. La actividad máxima se detectó en incubaciones a 65°C, a pH’s 7,8 y 8,2 con una energía de activación calculada de 16,8 kcal/mol y 19,3 kcal/mol y se detemiinaron las masas moleculares relativas: 41,7 ± 4,2 kDa y 39,8 ± 4,0 kDa para las enzimas hepática y renal respectivamente. La PBG-D de hígado de rata presenta un comportamiento michaeliano, con valores aparentes de Km y Vm de 12 ± 1,4 μM y 17,0 ± l,4 pmoles/mg.min. respectivamente y un n de Hill de 1, determinados a pH 8,2 y a 37°C. Estudios cinéticos revelaron que los iones Mg2+ (0-80 mM) y fosfato (0-20 mM) actúan como inhibidores incompetitivos, mientras que el amonio (0-50 mM) y la sulfarnerazina (0-2,0 mM) son inhidores no competitivos. En cambio, el ácido fólico (0-2,0 mM) actúa como un activador no esencial de la reacción. Para la enzima renal, los estudios cinéticos mostraron un comportamiento complejo, con una primera zona de saturación comprendida entre 5,0 y 7,0 μM y una segunda a partir de 66-70 μM. Los gráficos de dobles recíprocas son no lineales y exhiben un carácter bimodal que se traduce en dos constantes aparentes de afinidad, Km1: 0,8 ± 0,1 μM y Km2: 3,5 ± 0,4 μM. Comparando estas constantes cinéticas con las correspondientes para médula (Km: 0,8 ± 0,1 μM y Km2: 3,3 ± 0,4 μM) y corteza renal (Km: 0,9 ± 0,1 μM y Km2: 5,1 ± 0,6 μM), se sugiere que no existirian dos poblaciones proteicas distintas confinadas en diferentes estructuras. Además, la banda única obtenida (pI: 4,9) mediante la técnica de isoelectroenfoque, permitió descartar la presencia de isofonnas en riñón. Estudios cinéticos revelaron que el ion sodio (0-2,0 M) produjo un desplazamiento del punto de inflexión hasta obtener gráficos de inversas con una sola pendiente. A altas concentraciones de sustrato (7-66 uM) los iones Mg2+ (0-50 mM), fosfato (0-40 mM) y amonio (0-300 mM) actúan como inhibidores no competitivos. A bajas concentraciones de sustrato (0,8-7,0 pM) el Mg2+ es un inhibidor incompetitivo, el fosfato presenta un efecto dual y el amonio desplaza el punto de inflexión conforme aumenta su concentración. Estudios de inhibición realizados con PCMB, NEMI y DTNB demostraron la presencia de aminoácidos cisteína en el sitio activo, lo cual fue confirmado a través de estudios de grupos ionizables en la enzima y en los complejos enzima-sustrato. Se propone para la enzima renal, la existencia de por lo menos dos estados confonnacionales diferentes inducidos en el mismo sitio catalítico, ya sea por la unión del sustrato PBG o la no liberación del producto amonio o de ambos. La presencia de tales cambios confonnacionales permitiría la continuidad en la unión de las otras moléculas de PBG al sitio S, en presencia de intermediarios ES1, ES2 o ES3 en el sitio C, lo que originaria una diferente afinidad y actividad catalítr'ca final. Estos reordenamientos podrian producir finalmente cambios en los pasos limitantes de la reacción, lo cual sucedería a diferentes concentraciones de sustrato y daría lugar entonces a distintas constantes cinéticas.

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Registro:
Título : Estudios sobre la porfobiblinógeno-deaminasa de hígado y riñón de rata    
Autor : Noriega, Guillermo Osvaldo
Director : Batlle, Alcira María del Carmen
Director Asistente : Juknat, Adela Ana
Año : 1998
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Química Biológica
Centro de Investigaciones sobre Porfirinas y Porfirias (CIPYP)
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Químicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3022_Noriega
Idioma : Español
Area Temática : Química / Química Biológica
Palabras claves : PORFOBILINOGENO-DEAMINASA; PORFIRINAS; CONSTANTES CINETICAS; HIGADO; RIÑON; 
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