Tesis > Documento


Ver el documento (formato PDF)   Rodriguez Suarez, Roberto J..  "Estudios sobre el proceso de regulación reductiva de la Fructosa-1,6-Bisfostasa cloroplastídica de colza (Brassica napus)"  (1998)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
URL:
     
Resumen:
En las plantas, la Fructosa-1,6-Bisfosfatasa de cloroplastos (CFBPase) cataliza la defosforilación irreversible de la fructosa-1,6-fosfato en el ciclo de Benson-Calvin. La CFBPase es una enzima clave en la regulación de la asimilación del C02 y su actividad específica es fuertemente regulada por luz, a traves de una cascada reductiva via Tiorredoxina. Los principales objetivos fueron: i) obtener una CFBPase recombinante útil como modelo de la contraparte cloroplastídica, ii) empleando mutagénesis sitio-dirigida, caracterizar el rol de las cist(e)inas en su estabilidad estructural, modulación y actividad catalítica, iii) analizar la multiplicidad de loci para la CFBPase en el alotetraploide B.napus y en sus parentales diploides B.campestris y B.oleracea. Construímos una cDNA library de expresión de hojas de colza y obtuvimos varios clones codificando la CFBPase. Luego expresamos y purificamos de E.coli la proteína recombinante, que mostró alta actividad enzimática. Su caracterización estructural y funcional estableció que es virtualmente idéntica a la contraparte cloroplastídica. Preparamos varias mutantes sitio-dirigidas por reemplazo de cisteínas diferencialmente afectadas en sus propiedades regulatorias, algunas de las cuales resultaron parcial o constitutivamente activadas. Determinamos que la Cys157 es crítica y que las Cysl74 y 179 también son participantes de la modulación reductiva. Proponemos un mecanismo que involucra tres residuos Cys, y donde se requiere la formación de diferentes disulfuros en las distintas subunidades del homotetrámero. La actividad catalítica no disminuyó por el reemplazo de ninguna de las siete Cys de la enzima. También encontramos que existen al menos dos loci por complemento haploide para la CFBPase en B.napus y en sus parentales B.oleracea y B.campestris. Ambos loci se expresan en hojas verdes y las enzimas recombinantes poseen actividades muy similares. En conjunto, estos análisis podrían tener un elevado impacto en los estudios orientados a manipular la velocidad de asimilación de C02 y la partición "fuente/sumidero” del fotosintato en una especie económicamente importante como la colza.

Abstract:
In plants, CFBPase catalyses the irreversible dephosphorylation of fructose 1,6-bisphosphate in the Benson-Calvin Cycle. This enzyme is a key regulator of C02 assimilation rate and its specific activity is strongly modulated by light through a reductive cascade via Thioredoxin. The main goals were to, i) obtain a recombinant CFBPase suitable as a model of the plastidic counterpart, ii) using site-directed mutagenesis, characterise the role that cyst(e)ines play in its structural stability, activation and catalytic processes, iii) analyse the multiplicity of loci for the CFBPase in the allotetraploid B.napus and its parental diploids B.campestris and B.oleracea. We constructed a cDNA expression library from rapeseed leaves and obtained several clones coding for the CFBPase. We expressed and purified from E.coli the recombinant protein who evinced high enzymatic activity. Its kinetic and structural characterisation showed that it was almost identical to the plastidic counterpart. We prepared several site-directed cysteine replacement mutants differently affected in their regulatory properties, some of which were partially or constitutively activated. We determined that Cys157 is critical, and Cysl74 and Cysl79 are also participants in the reductive modulation. A novel mechanism involving three Cys residues, where the formation of mixed disulphides in distinct subunits of the enzyme tetramer are likely required, is suggested. None of the seven Cys residues were essential for the catalytic activity of CFBPase. We also found the occurrence of at least two loci per haploid genome coding for the CFBPase in B.napus, and its parental species B.oleracea and B.campestris. Both loci are expressed in green leaves and the recombinant enzymes behave very similarly. Taken together, these analysis would have a large impact in the manipulation of C02 fixation rate and source-sink photosynthate partition in economically important species such as rapeseed.

* A este resumen le pueden faltar caracteres especiales. Consulte la versión completa en el documento en formato PDF

Registro:
Título : Estudios sobre el proceso de regulación reductiva de la Fructosa-1,6-Bisfostasa cloroplastídica de colza (Brassica napus)     =    Studies on the reductive activation mechanism of chloroplast fructose-1,6-Biphosphatase (CFBPase) from oilseed rape (Brassica napus)
Autor : Rodriguez Suarez, Roberto J.
Director : Wolosiuk, Ricardo Alejandro
Año : 1998
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Instituto de Investigaciones Bioquímicas (IIB)
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Químicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3057_RodriguezSuarez
Idioma : Español
Area Temática : 
Palabras claves : BISFOSFATASA; CLOROPLASTO; REGULACION REDUCTIVA; CICLO DE CALVIN; BRASSICA; BISPHOSPHATASE; CHLOROPLAST; REDUCTIVE REGULATION; CALVIN CYCLE; BRASSICA
URL al Documento : 
URL al Registro : 
hola chau _gs.DocumentHeader_ chau2 _documentheader_ chau3
Estadísticas:
     http://digital.bl.fcen.uba.ar
Biblioteca Central Dr. Luis Federico Leloir - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires
Intendente Güiraldes 2160 - Ciudad Universitaria - Pabellón II - C1428EGA - Tel. (54 11) 4789-9293 int 34