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Ver el documento (formato PDF)   Barderi, Patricia Alejandra.  "Clonado, organización genómica y expresión de la glutamato dehidrogenasa NADP dependiente (GluDH-NADP) de Trypanosoma Cruzi"  (1998)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
Epimastigotes de Trypanosoma cruzi, el protozoo parásito que causa la enfermedad de Chagas, contienen dos glutamato dehidrogenasas diferentes (GluDHs), NAD y NADP dependientes. En este sentido los parásitos se asemejan a las bacterias, hongos y plantas y se diferencian de animales superiores que poseen sólo una enzima inespecífica para coenzima. La GluDH-NADP dependiente (EC 1.4.1.4) es un hexámero formado por subunidades idénticas de 47kDa, mostrando ser muy semejante a la correspondiente enzima de E. coli en cuanto a la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal. La forma NADP dependiente podría ser biosintética mientras la forma NAD dependiente podría tener un rol catabólico. La GluDH-NADP dependiente fue purificada a homogeneidad proteica a partir de epimastigotes de Trypanosoma cruzi mediante un protocolo mejorado que incluye cromatografía de afinidad en Blue Sepharose. Se determinó la secuencia de aminoácidos de 11 péptidos internos, obtenidos por digestión con BrCN, tripsina, endopeptidasa Arg-C o endopeptidasa Lys-C. Dichas secuencias, correspondientes aproximadamente al 30% de la molécula, mostraron una identidad del 74% con la enzima similar de E. coli. Utilizando un suero policlonal monoespecífico producido contra la proteína purificada se realizó el rastreo de una biblioteca de expresión genómica de T. cruzi en el vector λgt11. De esta forma pudo seleccionarse un único clon conteniendo 270 pb correspondientes al extremo 3' del gen que fue secuenciado completamente. Reacciones de PCR usando iniciadores construídos de acuerdo a la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal de la enzima madura y con la secuencia del clon correspondiente al extremo C-terminal pudieron clonarse y secuenciarse dos ORFs completos (TcGluDH1 y TcGluDH2). Las secuencias obtenidas muestran mayor homología con la enzima de Escherichia coli (70-72% de identidad), y menor homologia (52-57%)con la correspondiente enzima de eucariontes inferiores. A partir de la secuencia de ADN se predijo una proteína que contiene 446 aminoácidos. Usando el gen TcGluDH1 como sonda se realizaron experimentos de Southern blot, usando fragmentos de restricción o cromosomas enteros separados por electroforesis en campo pulsado, indicando variaciones entre los diferentes clones y cepas de parásitos, sugiriendo la presencia de varios genes codificando para la GluDH-NADP. La expresión de la enzima resultó ser diferente en los distintos estadíos del desarrollo. La forma epimastigote presenta mayor cantidad de ARNm y proteína (a juzgar por la actividad enzimática y ensayos de Western blot), en comparación con otras formas del parásito. El gen clonado TcGluDH1 fue expresado en E. coli, produciendo una enzima recombinante activa con constantes cinéticas similares a la enzima natural. A pesar de que las evidencias bioquímicas sugieren que la enzima se localiza tanto en el citoplasma como en la mitocondria, nuestros resultados indican una localización exclusivamente citosólica para la GluDH-NADP.

Abstract:
Epimastigotes of Trypanosoma cruzi, the parasitic protozoan which causes Chagas disease, contain two different glutamate dehydrogenases (GluDHs), one NADP-linked and one NAD-linked. The parasite therefore resembles bacteria, fungi and plants in this respect, and clearly differs from higher animals, which possess only one, coenzyme-unspecific, GluDH. The NADP-GluDH (EC 1.4.1.4), which is an hexamer made up of identical subunits of Mr 47.000, seems to be very similar to the enzyme from E. coli in terms of amino acid composition and N-terminal sequence. The HADP-GluDH might be biosynthetic, whereas the NAD-linked enzyme might have a catabolic role. The NADP-linked glutamate dehydrogenase has been purified to homogeneity from epimastigotes of Trypanosoma cruzi by an improved procedure using Blue Sepharose affinity chromatography. The amino acid sequences of 11 internal peptides obtained by digestion with CHBr, trypsin, Arg-C endopeptidase or LysC endopeptidase, showed 74% identity with the similar enzyme from E. coli, over about 30% of the molecule. Apolyclonal monoespecific antiserum against the purified enzyme was used for screening a genomic expression library of T.cruzi in λgt11. A clone containing 270 bps at the 3'-end of the gene was selected, and completely sequenced. Using PCR reactions with oligonucleotide primers synthesized according to the amino acid sequence of the N-terminus of the mature enzyme, and to the nucleotide sequence of a clone corresponding to the C-terminus, two complete ORFs (TcGluDH1 and TcGluDH2) were isolated and sequenced. The sequences obtained are most similar to that of the NADP-GluDH of Escherichia coli (70-72% identity), and less similar (52-57%) to those of lower eukaryotes. The protein predicted from DNA sequence contains 446 amino acids residues. Using TcGluDH1 as a probe, Southern blot experiments of both, restriction fragments and whole chromosomes separated by pulsed-field electrophoresis, indicated variations among different parasite strains and clones, and evidence for the presence of several genes. The expression of the enzyme was shown to be developmentally regulated, the epimastigote stage having a considerably larger amount of both, mRNA and protein (as judged from enzyme activity and Western blots), as compared with the other parasite forms. The cloned gene TcGluDH1 was expressed in E. coli, producing active recombinant enzyme with kinetic constants similar to those of the natural NADP-GluDH. Although biochemical evidence had previously suggested that the enzyme has a multiple localization (cytosolic and mitochondrial localization), our results suggested an exclusively cytosolic localization for NADP-GluDH.

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Registro:
Título : Clonado, organización genómica y expresión de la glutamato dehidrogenasa NADP dependiente (GluDH-NADP) de Trypanosoma Cruzi     =    Cloning, genomic organization and expression of the NADP-dependent glutamate dehydrogenase (NADP-GluDH) of Trypanosoma cruzi
Autor : Barderi, Patricia Alejandra
Director : Cazzulo, Juan José
Año : 1998
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Fundación Campomar. Instituto de Investigaciones Bioquímicas
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3065_Barderi
Idioma : Español
Area Temática : 
Palabras claves : TRYPANOSOMA CRUZI; GLUTAMATO DEHIDROGENASA NADPH DEPENDIENTE; CATABOLISMO DE AMINOACIDOS; PURIFICACION; SECUENCIACION DE ADN; COMPARACION DE SECUENCIAS; SECUENCIACION DE PROTEINAS; TRYPANOSOMA CRUZI; NADP-LINKED GLUTAMATE DEHYDROGENASE; AMINO ACID CATABOLISM; PURIFICATION; DNA SEQUENCING; SEQUENCE COMPARISION; PROTEIN SEQUENCING
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