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Ver el documento (formato PDF)   Barrio, María Marcela.  "Obtención y caracterización del anticuerpo monoclonal Fc-5.01, reactivo con cáncer de mama, melanoma y otros tumores humanos"  (1998)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
Con el objeto de producir anticuerpos monoclonales (AMCs) dirigidos contra antígenos (Ags) expresados por células tumorales indiferenciadas, los cuales podrían ser comunes a varias neoplasias, se utilizaron las células IIB-BR-G como inmunógeno. Esta línea celular de carcinoma mamario presenta características sumamente indiferenciadas y fue derivada de un tumor primario de mama altamente indiferenciado, que no expresa receptores hormonales. Se seleccionó un AMC denominado FC-5.01 (lgG2a), el cual reconoce distintos carcinomas humanos y el 100% de los melanomas malignos. Su reactividad con la mayoría de los tejidos normales es escasa, ya que FC-5.01 reconoce algunas células del sistema neuroendócrino, macrófagos y algunos túbulos contorneados proximales en el riñón, mayormente con un patrón intracelular. A nivel bioquímico, el Ag reconocido por FC-5.01 es una glicoproteína heterogénea (banda ancha con un peso molecular de 30-60 kDa) en melanomas y carcinomas humanos. El epitope reside en el núcleo protéico (25kD) y es presumiblemente conformacional, con puentes disulfuro implicados en el reconocimiento del AMC. En esta Tesis se demuestra que FC-5.01 reacciona con el Ag CD63, inicialmente descripto como un Ag asociado a melanoma, y miembro de la superfamilia Tetraspan o Tetraspaninas. La reactividad de FC-5.01 con CD63 se demostró por Western blot, con ensayos de inmunodepleción con otro anticuerpo anti-CD63 y por análisis de FACS (fluorescence activated cell sorting) de la línea celular de melanoma KM3 (CDGB-negativa) luego de la transfección con la copia genómica de CD63. El epitope reconocido por el AMC FC-5.01 es diferente del reconocido por otro AMC anti-CD63 (ME491), como se demostró por un radioimmunoensayo de inhibición cruzada. Opuestamente a lo propuesto para el AMC ME491, no se observaron diferencias significativas en Ia expresión de CD63 entre melanomas primarios y metastásicos usando AMC FC-5.01, por medio de inmunohistoquímica. Por inmunofluorescencia indirecta realizada a 4°C con células vivas, se determinó que el Ag reconocido por FC-5.01 está presente en las membranas plasmáticas de células IIB-BR-G y otras células neoplásicas. En células permeabilizadas, FC-5.01 co-localiza con el colorante naranja de acridina en vesículas acídicas (compartimiento lisosomal/endosomal). Por análisis de Scatchard realizado con células IB-BR-G, se calculó una constante de afinidad de 1.4 ± 0.4 x 10^7 M^-1 y 2.1 x 10^6 sitios antigénicos por célula. El AMC FC-5.01 no media reacciones citotóxicas contra células CD63+ (fijación de complemento ni ADCC= antibody dependent cellular cytotoxicity), pero el complejo FC-5.01-CD63 es eficientemente internalizado hacia vesículas intracitoplasmáticas, como se observó en un ensayo de inmunofluorescencia posterior a la incubación a 37°C. El catabolismo celular del AMC unido por las células IIB-BR-G se estudió usando -FC-5.01. Luego de 18 hs a 37°C, >70% de la radioactividad se encontró en el sobrenadante del cultivo como fragmentos degradados (TCA-solubles). En células IIB-BR-G se demostró rápida re-expresión del Ag luego de la internalización. El AMC FC-5.01 disminuyó la migración de células CD63+ en un ensayo de cámara de Boyden. Estas propiedades permitirían el uso del AMC FC-5.01 como un vehículo para dirigir diferentes compuestos dentro de células CD63+. Luego de haber logrado la radioinmunolocalización de xenotransplantes de carcinoma mamario humano creciendo en ratones nude (IIB-BR-GNUDE ) con -FC- 5.01, se formuló un kit de marcación en un paso, para obtener -FC-5.01, con posible utilidad en diagnóstico por imágenes. Este kit se preparó por reducción del AMC con 2-mercaptoetanol y la adición de difosfonato de metileno (MDP) como ligando transquelante. Luego de la marcación con eluído de generador, las especies marcadas se analizaron por ITLC (instant thin layer chromatography) y HPLC (high performance liquid chromatography). La eficiencia de marcación fue superior al 90% y la conservación de la inmunoreactividad se verificó con células IIB-BR-G. En el modelo IIB-BR-GNUDE se realizaron biodistribuciones e imágenes en cámara gamma con -FC-5.01. A las 24 hs la radioactividad se incrementó en los tumores (14.4 ± 5.3 % de la dosis inyectada/ gr tumor) y disminuyó en la sangre y los principales órganos, y los tumores se radioinmunodetectaron perfectamente en la cámara gamma. Los controles de calidad demostraron que el kit resulta estable por un período de hasta 120 días. Alícuotas de este mismo kit se inyectaron a dos pacientes con melanoma maligno (0.5 mCi/paciente), y en uno de ellos fue posible localizar, a las 24 hs, una metástasis en un gánglio linfático axilar, que ya había sido detectada por medio de tomografía computada. Este kit preparado para radioinmunodetección (RID) in vivo podría ser utilizado en el futuro con fines diagnósticos en pacientes con melanoma u otros tumores CD63+. Dados estos resultados, se utilizó el mismo modelo in vivo para experimentos de radioinmunoterapia (RIT). Se investigó la capacidad de -FC-5.01 para controlar el crecimiento de los tumores IIB-BR-GNUDE. En un primer experimento de RIT se observó una inhibición significativa del crecimiento tumoral (p<0.05) en animales portadores de tumor, tratados con -FC-5.01(900 μCi) fraccionados en tres dosis semanales, respecto de los animales control. Se observó cierto grado de toxicidad hematológica (pérdida de peso corporal, hipoplasia de la médula ósea, bajos recuentos de leucocitos totales). No se observaron regresiones o curas. También se observó incremento de la probabilidad de supervivencia debida al tratamiento con -FC-5.01 en uno de los experimentos. El nivel de toxicidad fue disminuído reduciendo la dosis de -FC-5.01 y por administración de G-CSF (granulocyte-colony stimulating factor) como complemento de la RIT.

Abstract:
In a research project directed to produce monoclonal antibodies (mAbs) towards undifferentiation antigens (Ags), which could be common to several tumors, immunization with extremely undifferentiated tumor cells was attempted. One of such cells is the human breast cancer cell line, IIB-BR-G, developed in our laboratory and derived from a highly undifferentiated breast tumor. A mAb designated FC-5.01(IgG2a) was selected, that binds to several human carcinomas and malignant melanoma. It has null or very low reactivity with most human normal tissues, with the exception that FC-5.01 binds to some cells from the neuroendocrine system, macrophages and some renal proximal convolute tubules. Biochemical studies indicate that FC-5.01 recognizes an heterogeneous glycoprotein (broad band between 30-60 kDa) in melanoma tumors. The epitope resides in the protein core and is presumably conformational, with disulphide bonds implicated in mAb recognition. In this Thesis it is demonstrated that mAb FC-5.01 reacts with CD63 Ag, which has been initially described as a melanoma-associated Ag, and is a member of the tetraspan superfamily. Reactivity of mAb FC-5.01 with CD63 was demonstrated by Western blot, immunodepletion assays and FACS analysis of the CD63-negative melanoma cells (KM3) after transfection with the genomic copy of CD63. The epitope recognized by mAb FC-5.01 is different from the epitope recognized by another anti-CD63 mAb, ME491, as shown by an inhibition radioimmunoassay. Opposite to what has been stated for mAb ME491, no significant differences were found in CD63 expression between primary and metastatic melanoma using mAb FC-5.01. The Ag recognized by mAb FC-5.01 is located in the plasma membranes of IIB-BR-G and other neoplastic cells, as detected by indirect immunofluorescence performed at 4°C on live cells. When the cells are permeabilized, mAb FC-5.01 recognizes acidic vesicles which colocalize with acridine orange (lysosomal/ endosomal compartment). Scatchard plot analysis performed on IB-BR-G cells demonstrated a 1.4 ± 0.4 x 10^7 M^-1 affinity constant and 2.1 x 10^6 antigenic sites per cell. mAb FC-5.01 is not able to mediate C (complement) fixation or antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) towards CD63+ cells, but the FC-5.01-CD63 complex is efficiently internalized into cytoplasmic vesicles, as shown by an acid wash immunofluorescence assay. Cellular catabolism of the bound antibody by IIB-BR-G cells was studied using -FC-5.01. At 18 hs, >70% of the radioactivity was present in the supernatant as degraded fragments (TCA-soluble). After internalization, rapid Ag re-expression could be demonstrated in IIB-BR-G cells. mAb FC-5.01 diminished migration of CD63+ cells, in a Boyden chamber assay. These properties would enable to use mAb FC-5.01 as a vehicle to target different compounds inside CD63+ cells. After demonstrating positive radioimmunolocalization with -FC-5.01 of human breast growing in nude mice, a one-step labelling kit was specially formulated for this mAb in order to obtain -FC-5.01. This kit was produced by mAb reduction with 2-mercaptoethanol and by adding methylene diphosphonate (MDP) as the transchelating ligand. The labeled species were analyzed by instant thin layer chromatography (ITLC) and high performance liquid chromatography (HPLC). Labeling efficiency was greater than 90%. Immunoreactivity was assessed on IIB-BR-G cells. Biodistribution of -labeled mAb FC-5.01 and tumor imaging were performed in nude mice bearing breast cancer IIB-BR-GNUDE xenografts. At 24 hs accumulation of increased in tumor (14.4 ± 5.3 % injected dose/ gr tumor) and decreased in blood and most organs. Quality control tests demonstrated that the kit was stable for up to 120 days. Therefore, animal studies demonstrated good and specific in vivo tumor targeting. Given these results, the ability of -FC-5.01 to influence tumor growth in vivo was further investigated. Preliminary radioimmunotherapy (RIT) experiments showed that there was a significative tumor growth inhibition (p<0.05) in animals treated with 900 μCi fractionated into three doses (one week apart), respect to control mice. Some degree of hematological toxicity was observed (bone marrow hipoplasia, low white blood cell counts). Increase in survival probability due to FC-5.01 treatment was also evident in one of such experiments. We did not observe tumor regressions or cures. Hematological toxicity was decreased by reducing -FC-5.01 dose and by administration of granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) as a complement for RIT.

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Registro:
Título : Obtención y caracterización del anticuerpo monoclonal Fc-5.01, reactivo con cáncer de mama, melanoma y otros tumores humanos     =    Production and characterization of monoclonal antibody FC-5.01, reactive with breast cancer, melanoma and other human tumors
Autor : Barrio, María Marcela
Director : Mordoh, José
Año : 1998
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Fundacion Campomar. Instituto de Investigaciones Bioquímicas
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3087_Barrio
Idioma : Español
Area Temática : 
Palabras claves : ANTICUERPO MONOCLONAL FC-5.01; AG CD63; INTERNALIZACION RADIOINMUNODETECCION; RADIOINMUNOTERAPIA; mAB FC-5.01; CD63 AG; RADIOINMUNODETECTION; RADIOINMUNOTHERAPY INTERNATION
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