Tesis > Documento


Ver el documento (formato PDF)   Guerchicoff Lemcke, Alejandra.  "Aspectos básicos y aplicados de la genética molecular de Bacillus thuringiensis"  (1999)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
URL:
     
Resumen:
Los inoculantes basados en Rhizobium son ampliamente usados en plantas luguminosas. Actualmente cepas bacterianas con funciones duales (por ejemplo: fijación de nitrógeno y actividad insecticida) pueden ser una alternativa para el manejo orgánico de pestes de insectos (Madhavi et al., 1993 and 1994). También pueden ser usadas para proteger semillas, reduciendo el uso de insecticidas químicos. El gen cry 4B de B. thuringiensis israelensis que codifica para una proteína tóxica para díptero fue usado como modelo. Para introducir dicho gen se usó el plásmido pTR101, un vector altamente estable, en Rhizobium en ausencia de presión de selección. Las construcciones fueron introducidas en Rhizobium fredii 191 y Rhizobium meliloti 1021, mediante conjugación tripartita con un plásmido ayudante. La expresión fue estudiada mediante Western blot de extractos crudos utilizando un anticuerpo específico contra la proteína Cry4B recombinante. Se observaron reareglos que dieron lugar a deleciones, pero a pesar de esto un polipéptido reactivo se detectó en ambos Rhizobios. Dado que en Argentina muchas pestes de coleópteros y nematodos constituyen un serio problema para cultivos de alfalfa y soja, entre otros, el gen cry3A de B.thuringiensis tenebrionis (Krieg et al., 1983) fue introducido en Rhizobium meliloti 1021. Se eligió al vector de amplio rango pRK404, para evitar que se produzcan reareglos. Este plásmido posee un origen de replicación derivado del RK2, lleva resistencia a kanamicina, puede ser movilizado con una alta frecuencia usando un plásmido ayudante. Los análisis por PCR confirmaron la presencia de este gen en Rhizobium meliloti 1021 pero se observó un bajo nivel de expresión. La presencia del plásmido recombinante no afectó la capacidad nodulativa ni de crecimiento de las plantas inoculadas. La presencia de proteíans tóxicas con actividad citolítica y hemolítica es una característica de Bacillus thuringiensis entre este grupo la primera descubierta fue Cyt1 la citolisina de Bacillus thuringienisis israelensis (Bti) (Earp, D. J., et al. 1987, Ward, E. S., et al. 1984). En esta subespecie hemos detectado la presencia de otro gen cyt, altamente homólogo a la citolisina de 29 KDa, Cyt2 de la subespecie kyushuensis (Drobniewski, F, A., et al. 1989. Knowles, B, H. et al. 1992). Este gen mapea “río arriba “ del gen cry4B en el megaplásmido de 72 Md de la cepa 4Q2-72. El análisis de la secuencia reveló una región 5' estabilizadora del mARN similar a las descriptas para otros genes cry. Los análisis de Western blot revelaron la presencia de un polipéptido inmunoreactivo en Bacillus thuringiensis subespecie 1884 y 4Q2-72. Mediante experimentos de PCR y de Southern blot se confirmó la presencia de este gen en otras subespecies mosquitocidas de Bacillus thuringiensis. Notablemente la subespecie tenebrionis que clasifica dentro del serotipo morrisoni, con actividad tóxica para coleóptero, también lleva este gen. Por otro lado, se obtuvieron resultados negativos con las cepas tóxicas para lepidóptero kurstaki HD-l y aizawai HD-137. Así como los genes cry, que codifican toxinas larvicidas en Bacillus thuringiensis, los genes cyt también parecen constituir una amplia y diversa familia de genes altamente relacionados.La presencia de hemolisinas Cyt ha sido asociada típicamente con cepas de Bacillus thuringiensis con diferente patotipo(Chang, C., et al. 1993; Crickmore, N., et al. 1995). Este es el caso del serotipo morrisoni el cual incluye cepas bilógicamente activas contra larvas de lepidóptero y coleóptero. Mientras que las proteínas Cyt fueron encontradas en la mayoría de las cepas mosquitocidas estudiadas, es probable que más de una citolisina coexista en las cepas más tóxicas para dípteros, como las subespecies israelensis y morrisoni PG14, sugiriendo esto una correlación entre la potencia mosquitocida y la actividad hemolítica. La secuencia parcial de diferentes genes cyt de cepas mosquitocidas y no mosquitocidas fue determinada y en base a estos datos se construyó un árbol filigenético. , Nuestros encuentros sugieren que las proteínas Cyt tienen un espectro de distribución más amplio que el que hasta ahora se conocía y probablemente también de actividad contra insectos. Teniendo en cuenta las diferencias en el mecanismo de acción entre las proteínas Cry y Cyt se sugiere que éstas últimas pueden ser un factor importante en el manejo de la resistencia desarrollado por los insectos a toxinas Cry . Finalmente se sugiere que la actividad biológica de los cristales intactos de muchas subespecies de Bacillus thuringiensis puede ser considerada como la resultante de una compleja interacción entre las toxinas Cry y Cyt.

Abstract:
Rhizobium-based inoculants are widely used in leguminous crops. Improved strains with dual functions (i.e, nitrogen fixing and insecticidal) could be successfully applied to organic pest management (Madhavi et al., 1993 and 1994). They could also be used as seed protectants, reducing the use of chemical insecticides. The cry4B gene from B. thuringiensis israelensis coding for an anti-dipteran toxin (Goldberg, L., 1977) was used as a model for expression. A highly stable plasmid vector (pTR101) was chosen in order to introduce insecticidal genes in Rhizobium in the absence of selective pressure. Constructions were introduced into Rhizobium fredii 191 and Rhizobium meliloti 1021, through triparental matings with a helper plasmid. Expression was monitored by Western blotting of crude extracts using a specific antibody raised against recombinant Cry4B protein. Although rearrangements leading to deletions were observed, an immunoreactive polypeptide was reproducibly detected in both Rhizobia. Considering that pests such as Coleoptera in alfalfa or Nematoda in soybean constitute a serious problem in Argentina, the cry3A gene from B.thuringiensis tenebrionis (Krieg et al., 1983) was also introduced into Rhizobium meliloti 1021, in order to produce strains with anti-coleopteran activity. A broad host range cloning sistem vector, pRK404, was chosen as alternative vector in order to prevent rearrangements. The tetracycline-resistant plasmid component of this system, pRK404, contains a functional RK2 replicon and can be mobilized at high frequency by using a helper plasmid, but is non-self-transmisible. PCR amplification analysis confirmed the presence of this gene in Rhizobium meliloti 1021, low level of expression was observed. The presence of the recombinant plasmids did not affect either the nodulativen capacity or the growth of the inoculated plants. Mosquitocidal Bacillus thuringienisis strains show as a common feature, the presence of toxic proteins with cytolytic and hemolytic activities, being Cyt1 the characteristic cytolytic toxin of Bacillus thuringienisis israelensis (Bti) (Earp, D. J., et al. 1987, Ward, E. S., et al. 1984) In this species we have detected the presence of another cyt gene, highly homologous to cyt2, that codes for the 29 kDa cytolytic toxin from kyushuensis subspecies (Drobniewski, F, A., et al. 1989. Knowles, B, H. et al. 1992). This gene maps upstream cry4B, on the 72 Md plasmid of strain 4Q2. Sequence analysis revealed, as remarkable feature a 5’ mRNA stabilizing region similar to those described for other cry genes. As predicted by sequence analysis, Western blot reveal Cyt2 cross recating polypeptides in 4Q2 and Bti 1884. PCR amplification and Southern blot analysis confirmed the presence of this gene in other mosquitocidal subspecies. Interestingly, the anti-Coleopteran subspecies tenebrionis belonging to the morrisoni serotype, also showed this gene. On the other hand, negative results were obtained with the anti-Lepidopteran subspecies kurstaki HD-l and aizawai HD-137. As is the case with cry genes, coding for larvicidal delta endotoxins, in Bacillus thuringienisis, the cyt genes for hemolytic toxins seem to form a large and diverse family of highly related genes. The occurrence of Cyt hemolytic toxins has been tipically associated with the host range of Bacillus thuringienisis strains of different pathotypes. This is the case for the morrisoni serovar, that includes strains biologically active against both lepidopteran and coleopteran larvae. While Cyt proteins occur in almost all the mosquitocidal strains studied, it seems that more than one Cyt toxin coexist in highly toxic antidipteran strains, like Bacillus thuringienisis israelensis and morrisoni PG14, suggesting'a correlation betweeen mosquitocidal power and hemolitic activity. Partial DNA sequence for different cyt genes from mosquitocideal and no mosquitocidal strains were determined and a phyologenetic tree was constructed. This novel finding suggests that Cyt protein may have an even broader spectrum of distribution and probably of activity against insects and, owing to their different mechanism of action in comparation to Cry proteins, they might be useful in managing resistance to Cry toxins. These findings suggest that the biological activity of the parasporal cristal of many Bacillus thuringienisis strains, should be viewed as the result of a complex overall interaction between Cry and Cyt toxins.

* A este resumen le pueden faltar caracteres especiales. Consulte la versión completa en el documento en formato PDF

Registro:
Título : Aspectos básicos y aplicados de la genética molecular de Bacillus thuringiensis    
Autor : Guerchicoff Lemcke, Alejandra
Director : Ugalde, Rodolfo A.
Año : 1999
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Fundacíon Campomar. Instituto de Investigaciones Bioquímicas (IIB)
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Químicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3106_GuerchicoffLemcke
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Ingeniería Genética
Palabras claves : BACILLUS THURINGIENSIS; BACTERIAS FIJADORAS DE INTROGENO; GENES LARVICIDAS; GENES HEMOLITICOS; B. THURINGIENSIS; ENTOMOCIDAL GENES; HEMOLYTIC GENES; NITROGEN FIXING; RHIZOBIUM
URL al Documento : 
URL al Registro : 
hola chau _gs.DocumentHeader_ chau2 _documentheader_ chau3
Estadísticas:
     http://digital.bl.fcen.uba.ar
Biblioteca Central Dr. Luis Federico Leloir - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires
Intendente Güiraldes 2160 - Ciudad Universitaria - Pabellón II - C1428EGA - Tel. (54 11) 4789-9293 int 34