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Ver el documento (formato PDF)   Díaz Añel, Alberto Marcelo.  "Caracterización de una ARN Helicasa de Trypanosoma cruzi clonada por el método de Differential Display"  (1999)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
Una de las últimas técnicas aplicadas en biología molecular para detectar diferentes niveles de transcripción en distintos estadios de un mismo tipo celular es el Differential Display. Este ensayo se basa en la técnica de RT-PCR, utilizando un oligo dT “anclado” que se une al nacimiento del pon A+ de los ARN mensajeros, y un oligonucleótido corto de secuencia al azar que, en diferentes combinaciones, van a amplificar un set de bandas característico para cada par de oligos elegidos. Estas reacciones se corren en un gel de poliacrilamida desnaturalizante y se observan por autorradiografía. De esta forma se comparan ambos estadios celulares y se recuperan del gel aquellas bandas que muestren una amplificación diferencial como producto de distintos niveles de ARN mensajeros. Utilizando el Differential Display en los estadios no infectivo (epimastigotes) e infectivo (trypomastigotes metacíclicos) del parásito Trypanosomacruzi, causante de la enfermedad de Chagas, se purificaron varias bandas de expresión diferencial. Una de ellas aplicada como sonda en un Northern-blot demostró tener una transcripción entre 8 y 9 veces mayor en trypomastigotes metacíclicos. A partir de una biblioteca genómica realizada en el bacteriófago A Fix, se aisló un clon positivo para esta banda que, una vez secuenciado y comparado en bancos de datos, dió una homología de hasta el 46 % a nivel de aminoácidos con diferentes ARN helicasas. Estas proteínas pertenecen a la familia de las proteinas DEAD Box y participan en el relajamiento de estructuras de ARN doble cadena. Por lo tanto son importantes en procesos como transcripción, traducción, ensamblado de ribosomas, splicing y editing.Además se ha descripto su participación en diferenciación y desarrollo celular, por lo cual se abre un campo muy importante con en el estudio de la participación de estas proteinas en los procesos de metaciclogénesis e infectividad del Trypanosoma cruzi. Por otro lado se demostró por Southern-blot que, a diferencia de la mayoría de los genes conocidos de Trypanosoma cruzi, el gen de esta ARN helicasa es de única copia en el genoma. Ensayos de Cromo-blot con ia región que codifica al carboxilo terminal de la proteína mostraron que este gen se encuentra representado en por lo menos nueve cepas del parásito. Por último, se demostró que esta ARN helicasa posee una especificidad enzimática con dirección 3’-5’ sobre transcriptos realizados in-vitro, con una aparente independencia de ATP o GTP, como ocurre con algunos miembros de esta familia El descubrimiento de este gen de transcripción diferencial entre ambos estadios de la metaciclogénesis de T. cruzi y la caracterización parcial de su función enzimática, son el principio para estudiar su participación en la diferenciación y/o infectividad de este parásito y nos permitirá conocer un poco más de este proceso del cual se sabe tan poco y que es parte del comienzo de la enfermedad de Chagas en los huéspedes vertebrados, entre ellos el hombre.

Abstract:
One of the last techniques applied in molecular biology to detect different transcription levels in different stages of one cellular type is the Differential Display. This assay is based on the technique of RT-PCR, using an oligo dT “anchored” that anneals to the birth of the messenger RNAs poly A, and a short oligonucleotide of at random sequence that, in different combinations, they will amplify a characteristic set of bands for each couple of selected oligos. These reactions are run on a dennaturing polyacrylamide gel and they are observed by autoradiography. This way both cellular stages are compared and we can recover of the gel those bands that show a differential amplification as product of different levels of messenger RNAs. Using the Differential Display in the stages non infective (epimastigotes) and infective (metaciclic trypomastigotes) of the parasite Trypanosoma cruzi, causing of the Chagas’ illness, we purified several bands of differential expression. One of them applied as probe in a Northern-blot demonstrated to have a transcription level between 8 and 9 times higher in metaciclic trypomastigotes. Starting from a genomic library carried out in A Fix bacteriophage, a positive clone was isolated for this band that, once sequenced and compared in databases, showed an homology of until 46% at level of aminoacids with different RNA helicases. These proteins belong to the family of the DEAD Box proteins and they participate in the relaxing of RNA double chain structures. Therefore they are important in processes like transcription, translation, ribosome assembling, splicing and editing. Also it has been described their participation in diferentiation and cellular development, reason why a very important field opens up with in the study of the participation of these proteins in the metaciclogénesis processes and infectivity of Trypanosoma cruzi. On the other hand it was demonstrated by Southern-blot that, contrary to most of the well-known genes of Trypanosoma cruzi, the gene of this RNA helicase is single copy in the genome. Assays of Chromo-blot with the region that codes to the carboxy terminal of the protein, showed that this gene is represented in at least nine strains of the parasite. Lastly, it was demonstrated that this RNA helicase possesses an enzymatic specificity with 3’-5' direction with transcripts carried out in-vitro, with an apparent independence of ATP or GTP, like it happens with some members of this family. The discovery of this gene of differential transcription between both stages of the T. cruzi metacyclogenesis, and the partial characterization of their enzymatic function, is the principle to study their participation in the diferentiation and/or infectivity of this parasite, and it will allow to us to know a little more about this process of which is known so little and that it is part of the beginning of the Chagas’ illness in the vertebrate guests, among them the man.

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Registro:
Título : Caracterización de una ARN Helicasa de Trypanosoma cruzi clonada por el método de Differential Display    
Autor : Díaz Añel, Alberto Marcelo
Director : Flawiá, Mirtha María
Año : 1999
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular, "Dr. Héctor N. Torres" (INGEBI)
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3114_DiazAnel
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Parasitología
Biología / Biología Molecular y Celular
Palabras claves : ARN HELICASA; METACICLOGENESIS; DIFFERENTIAL DISPLAY; TRYPANOSOMA CRUZI; DIFERENCIACION; INFECTIVIDAD; GEN COPIA UNICA; ACTIVIDAD 3’-5’; RNA HELICASE; METACYCLOGENESIS; DIFFERENTIAL DISPLAY; TRYPANOSOMA CRUZI; DIFERENTIATION; INFECTIVITY; SINGLE COPY GENE; 3’-5’ ACTIVITY
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