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Ver el documento (formato PDF)   Pereira, Claudio Alejandro.  "Metabolismo de L-arginina en Trypanosoma cruzi"  (1999)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
Apartir de los resultados obtenidos en nuestro laboratorio sobre la modulación de la motilidad de los epimastigotes de Trypanosoma cruzi a través de los distintos efectores de la ruta metabólica del óxido nítrico, se planteó la necesidad de estudiar en forma más amplia el metabolismo del sustrato de la óxido nítrico sintasa, la L-arginina. Inicialmente se describió el transporte de este aminoácido en epimastigotes de T. cruzi en fase logaritmica de crecimiento. Se determinaron los parámetros cinéticos y sus características bioquímicas, siendo algunas de las más relevantes, las que se detallan a continuación: - El transportador presenta una alta afinidad por el sustrato (Km = 4.16 μM) en comparación con otros sistemas similares. - Es sumamente específico ya que no se inhibe competitivamente en presencia de aminoácidos naturales como así tampoco por análogos estructurales de la arginina. Sólo se observó una disminución significativa en la incorporación de L-arginina en presencia de homoarginina, canavanina y D-arginina. - Es saturable por sustrato, independiente de Na+,pero dependiente de ATP. - Es afectado en forma específica por el tiempo de "ayuno"de L-arginina. Cuando se estudió el destino de la arginina incorporada a las células en 30 minutos, se observó que el 4.3% se incorpora a proteínas, el 68.6% queda formando parte del conjunto de aminoácidos libres y un 27.1% se identificó como fosfoarginina. La presencia de fosfoarginina como fosfágeno involucrado en la regeneración del ATP,hidrolizado principalmente en el flagelo del parásito, explica probablemente la necesidad de un transportador específico de las caracteristicas descriptas. La relevancia de esta actividad biológica como posible blanco terapéutico tripanosomicida está dada por ser éste un sistema diferencial entre el parásito y el hospedador humano, quien carece de esta enzima pues utiliza la creatina como fosfágeno. Estas evidencias nos llevaron a centrar el interés del trabajo en el sistema transportador de arginina y la enzima arginina kinasa. En la segunda parte del trabajo se caracterizó bioquímicamente la enzima arginina kinasa. Se midió la actividad enzimática tanto in vivo como In vitro, se determinó su localización subcelular y sus parámetros cinéticos (Km para arginina, 0.33 mM y para ATP 0.31 mM). Se purificó parcialmente la actividad arginina kinasa en dos pasos cromatográficos, uno de intercambio iónico y el segundo de filtración molecular. También se estudiaron sus requerimientos de ATP y cationes bivalentes. Se ensayaron in vitro inhibidores potenciales de la enzima, siendo los más relevantes,el análogo natural canavanina, la homoarginina y la histidina. Se analizó también la presencia de la arginina kinasa en otros organismos, encontrándose dicha actividaden otras cepas y especies del género Trypanosoma y también en los denominados “trypanosomátidos inferiores" como Herpetomonas y Leptomonas. Finalmente se clonó el gen que codifica para la arginina kinasa de T. cruzi utilizando técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR)y rastreo en bibliotecas genómicas. El gen de 1074 pb codifica para una proteína de 357 aminoácidos y un peso molecular de 40 kDa (GenBank # AF070451),el cual probablemente se encuentre como copia única dentro del genoma. El análisis de la secuencia obtenida demuestra un alto grado de conservación evolutiva. El gen completo de la enzima se expresó en un sistema heterólogo (Escherichia coll) demostrándose actividad arginina kinasa de la proteína recombinante.

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Registro:
Título : Metabolismo de L-arginina en Trypanosoma cruzi    
Autor : Pereira, Claudio Alejandro
Director : Flawiá, Mirtha M.
Año : 1999
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología (INGEBI)
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3140_Pereira
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Parasitología
Biología / Biología Molecular y Celular
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