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Ver el documento (formato PDF)   Buschiazzo, Alejandro.  "Estudios moleculares de sialidasas de Trypanosomátidos : relación estructura/función"  (1999)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
La trans-sialidasa de Trypanosoma cruzi es una enzima cuya existencia fue postulada en 1985 cuando se probó que este parásito intracelular de células de mamífero, posee ácido siálico conjugado a sus propias moléculas de superficie. La trans-sialidasa fue posteriormente purificada, caracterizada enzimáticamente y su gen clonado. Así se demostró en primer lugar, que era una actividad novedosa como transglicosidasa, ya que no utiliza como sustrato un dador nucleótido-azúcar, que en todas las otras sialiltransferasas cucarióticas conocidas, es el CMP-siálico. En segundo lugar, el análisis de secuencia reveló una lejana pero evidente homología con varias sialidasas bacterianas, y no con las sialiltransferasas eucariotas. En los últimos años han surgido distintos tipos de evidencias experimentales, que involucran a la trans-sialidasa en los mecanismos de adhesión/invasión de T. cruzi a las células del mamífero huésped, en el escape temprano de parásitos invasivos de la vacuola parasitófora de la célula hospedadora y en la evasión del camino alternativo de fijación del complemento. La actividad de trans-sialidasa, ha sido detectada hasta el momento sólo en T. cruzi y en dos parásitos tripanosomátidos emparentados, T. brucei y Endotrypanum sp. En algunos otros tripanosomátidos se han encontrado sialidasas, pero sin actividad de transferasa detectable, como en el caso de T. rangeli. Hasta ahora no se sabía si la sialidasa de este parásito no patogénico, estaba relacionada con la trans-sialidasa. Con el objetivo de comprender el(los) mecanismo(s) en el(los) que la trans-sialidasa está involucrada, en relación a la interacción huésped/parásito, en este trabajo de Tesis se ha avanzado en distintos aspectos del estudio molecular de la trans-sialidasa de T. cruzi y la sialidasa de T. rangeli: 1. Se optimizaron los sistemas de expresión y purificación de la trans-sialidasa recombinante con el fin de obtener grandes cantidades de proteína >95% pura. 2. Se utilizó trans-sialidasa recombinante pura como material inicial para cristalizar y comenzar estudios cristalográficos por difracción de rayos X, tendientes a resolver la estructura tridimensional de la misma. Además de las variaciones convencionales en los métodos y condiciones de cristalización, y mientras no se obtengan cristales adecuados, se procedió a buscar la separación de dominios parciales de la proteina para cristalizar de forma independiente. 3. En paralelo con los puntos anteriores, se demostró que la sialidasa de T rangelí es homóloga a la trans-sialidasa dc T. cruzi. Para ello se purificó la sialidasa nativa a partir de sobrenadantes de cultivo de T. rangeli, se microsecuenció y se logró clonar trece genes homólogos, miembros de lo que hemos denominado la familia multigénica de la sialidasa de T. rangeli. 4. Tres de los genes clonados codifican proteínas recombinantes con actividad de sialidasa comparable a la de la enzima nativa cuando se expresan en Escherichia coli. Uno de ellos fue secuenciado completamente, revelando una identidad en aminoácidos de 68.9% cuando se lo compara con la trans-sialidasa de T. cruzi, aumentando a una similitud dc 86.7% si se admiten sustituciones conservativas. 5. Se cristalizó la enzima nativa de T.rangeli sola y ligada a un inhibidor competitivo. Se resolvió su estructura tridimensional a partir del patrón de difracción de rayos X, hasta una resolución de 2.2Å. En paralelo se resolvió la estructura tridimensional de la misma proteína acomplejada al inhibidor hasta 2.9Å. 6. Se modelizó la estructura tridimensional de la trans-sialidasa, tomando como referencia inicial las coordenadas atómicas de la sialidasa, dada la gran homología entre las dos proteínas. 7. Se construyeron y expresaron moléculas quiméricas entre ambas enzimas con el objetivo de avanzar en la definición de regiones y/o residuos claves en la transglicosilación.

Abstract:
The trans-sialidase from Trypanosoma cruzi is an enzyme, which was predicted to exist in 1985, in order to explain the presence of sialic acid bound to surface molecules of this intracellular parasite of mammalian cells. Trans-sialidase was later purified, enzymatically characterized and its gene cloned. In this way it was shown in the first place, that it is a novel type of transglycosidase, since it does not use a sugar-nucleotide as the donor substrate, which is CMP-sialic acid in all the other known cukaryotic sialyltransferases. In the second place, the sequence analysis revealed a low level of homology with several bacterial sialidases, and not with eukaryotic sialyltransferases. Over the last few years different types of experimental evidence have appeared. involving the trans-sialidase of T. cruzi in the adhesion/invasion mechanisms that the parasite uses in the interaction with mammalian host cells, in the early escape of invasive parasites from the parasitophorous vacuole in recently invaded host cells and in the parasite evasion from the alternative pathway of complement activation. Trans-sialidase activity has been detected only in T. cruzi and in two related Trypanosomatidae parasites. T. brucei and Endotrypunum sp. Sialidases have been identified in some other Trypanosomatidae, but lacking detectable transferase activity, as in the case of T. rangeli. Until now it was not known if the sialidase from this non-pathogenic parasite, was related with trans-sialidase. In order to understand the mechanism(s) in which trans-sialidase is involved, with respect to hostcell/ parasite interaction, this PhD Thesis has contributed to advance in different aspects of the molecular study of the trans-sialidase from T. cruzi and the sialidase from T. rangeli: 1. The systems ofexpression and purification of recombinant trans-sialidase were optimized with the purpose of obtaining great quantity of highly pure (>95%) protein. 2. Pure recombinant trans-sialidase was used as the starting material in crystallization screenings, looking for suitable crystals to perform crystallographic studies by X ray diffraction, that would render its three-dimensional structure. Added to the conventional matrix variations in the crystallogonesis screenings, and until suitable crystals appear, a simultaneous approach was performed, searching for the separation of partial domains of the protein that could be crystallized independently. 3. In parallel with these points, it was demonstrated that the sialidase from T rangei is homologous to the the trans-sialidase of T. cruzi. With this purpose, the native sialidase was purified from culture supernatants of T. rangeli, and microsequenced. Thereafter, thirteen homologous genes were cloned, and grouped in what we have denominated the multigenic sialidase family of T. rangeli. 4. Three of the cloned genes encode recombinant proteins with sialidase activity, similar to the native enzyme's, when they are expressed in Escherichia coli. One of them was completely sequenced, showing an overall identity of 68.9% at the amino acid level, compared to the trans-sialidase from T cruzi. The similarity increases to 86.7% if conservative substitutions are admitted. 5. The T. rangeli native enzyme was crystallized, alone and complexed with a competitive inhibitor. Its three-dimensional structure was solved by X ray diffraction pattern analysis, up to 2.2Å resolution. The three-dimensional structure of the complex with the inhibitor was solved simultaneously to 2.9Å. 6. The three-dimensional structure of the trans-sialidase from T. cruzi was modelled, taking the atomic coordinates of the sialidase, as initial reference, given the high homology level between both proteins. 7. Chimeric molecules between both proteins were constructed and expressed. with the purpose of advancing in the definition of key regions and/or residues responsible for the transglycosylation activity.

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Registro:
Título : Estudios moleculares de sialidasas de Trypanosomátidos : relación estructura/función    
Autor : Buschiazzo, Alejandro
Director : Frasch, Alberto Carlos C.
Año : 1999
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Fundación Campomar. Instituto de Investigaciones Bioquímicas (IIB)
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Químicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3145_Buschiazzo
Idioma : Español
Area Temática : 
Palabras claves : ENFERMEDAD DE CHAGAS; TRANS-GLICOSILACION; MECANISMO CATALITICO; ESTRUCTURA DE PROTEINAS; CRISTALOGRAFIA POR RAYOS X; SIALIDASAS; TRANS-SIALIDASAS; CHAGAS’ DISEASE; TRANS GLYCOSYLATION; CATALYTIC MECHANISM; PROTEIN STRUCTURE; X RAY CRYSTALLOGRAPHY; SIALIDASES; TRANS-SIALIDASES
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