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Ver el documento (formato PDF)   Capurro, Mariana Isabel.  "Caracterización del anticuerpo monoclonal FC-2.15, dirigido contra carcinomas humanos y reactivo con LewisX : Estudio de sus propiedades funcionales in vitro y ex vivo"  (1999)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
Este trabajo de Tesis se ha basado en la producción de anticuerpos monoclonales (AMC) dirigidos contra las células troncales de carcinoma mamario humano. la caracterización e identificación de los antígenos (Ag) reconocidos por los mismos y la evaluación de la posible utilidad diagnóstica y terapéutica de dichos AMCs. Para su obtención, se inmunizaron ratones Balb/c con células provenientes de un paciente con un carcinoma de mama agresivo y altamente indiferenciado, negativo para la expresión de ER y PgR, estrategia seguida con la idea de minimizar la producción de AMCs dirigidos contra Ags asociados a la diferenciación celular. De los hibridomas obtenidos fue seleccionado el AMC FC-2.15, de isotipo IgM, el cual reacciona con la mayoría de los carcinomas mamarios humanos, independientemente de su tipo histológico y grado de diferenciación, reconociendo en los mismos al 80 % de las células tumorales y al 90 % de las células proliferantes del tumor, entre las que se encuentran las células troncales. El AMC FC-2.15 reconoce otras neoplasias, como carcinoma de colon y leucemia mieloide crónica y presenta escasa reactividad con la mayoria de los tejidos normales, siendo la principal reacción cruzada con los leucocitos polimorfonucleares (PMN). En cuanto al Ag FC-2.15, la caracterización bioquímica inicial indicó un Ag de naturaleza glicoproteica, residiendo el epitope en la parte hidrocarbonada del mismo. Posteriores experimentos demostraron que el AMC FC-2.15 reconoce específicamente al trisacárido Lewis˟ o CD15, terminalmente expuesto. Esta conclusión está basada tanto en el reconocimiento específico del AMC FC-2.15 por diferentes estructuras conteniendo Lewis˟ como en la inhibición observada en un ELISA realizado utilizando un AMC comercial anti-CD15 como inhibidor. Asimismo, se determinó que el AMC FC-2.15 no presenta reacción cruzada con el tetrasacárido sialil Lewis˟, ni con su isómero Lewisª, así como tampoco con antígenos de grupo sanguíneo A o B La reactividad del AMC FC-2.15 en los diferentes tejidos FC-2.15 -positivos fue analizada por Western Blot sobre extractos de membrana y caracterizada determinando el efecto de digestiones enzimáticas (con PNGasaF y Neuraminidasa) en la persistencia del Ag. Los resultados obtenidos revelaron que Lewis˟ puede estar formando parte tanto de N-glicoproteínas como de O-mucinas. Según el tipo celular estudiado, Lewis˟ está presente en N-glicoproteínas exclusivamente (bandas de 250, 185 y 105 kDa en muestras de PMN y leucemia), predominantemente en N-glicoproteínas (bandas de 155 y 135 kDa, acompañadas con mucinas de mayor peso molecular, en células de carcinoma de colon T-84) o predominantemente en O-mucinas (células de carcinoma de mama MCF-7).También puede variar la cantidad de lactosaminoglicanos portando sialil Lewis˟, desde la ausencia (MCF-7), pasando por una baja proporción respecto de los Lewis˟-lactosaminoglicanos (PMN) hasta llegar a un gran predominio de los mismos en leucemias y T-84. Puede concluirse, por lo tanto, que PMN normales y diferentes células tumorales pueden expresar residuos Lewis˟ y sialil Lewis˟ en muy diferente proporción y unidos a diferentes proteínas, aunque la relevancia de Lewis˟ en condiciones normales y patológicas tiene que ser aún establecida. En cuanto a las propiedades funcionales del AMC FC-2.15, numerosos experimentos se han realizado en esta Tesis tendientes a caracterizar la interacción del AMC FC-2.15 con PMN y con MCF-7, tanto in vitro como en un sistema ex vivo de circulación sanguínea (SEVCS). Ensayos de aglutinación han demostrado que el AMC FC-2.15 induce la agregación homotípica de PMN in vitro y forma agregados heterotípicos entre PMN y células tumorales Lewis˟-positivas. Ensayos de liberación de han revelado que el AMC FC-2.15 ejerce un fuerte efecto citotóxico sobre los PMN y células MCF-7 por fijación de complemento humano. Posteriormente, con la idea de aproximar a las condiciones en las que el AMC FC-2.15 interacciona in vivo, el ensayo de liberación de fue realizado en sangre entera en circulación en un SEVCS. Contrariamente a lo esperado, el AMC FC-2.15 aglutina, pero no lisa, a los PMN mientras que la lisis de MCF-7 en dicho sistema es prácticamente normal. Estas observaciones permitieron plantear la posibilidad de que en el SEVCS los PMN serían inducidos a agregarse mas rápidamente por la suma de dos mecanismos distintos: el AMC FC-2.15 que activa a los PMN y el flujo aplicado. En la medida que los agregados van siendo formados, habría un impedimento estérico progresivo para el acceso de los factores del sistema de complemento a la porción Fc del AMC FC-2.15 y por ende los grumos de PMN formados no serían lisados. Los experimentos realizados posteriormente validaron esta hipótesis puesto que demostraron que el AMC FC-2.15 no lisa agregados homotípicos de PMN preformados en ensayos in vitro por un lado y que el AMC FC-2.15 es capaz de lisar a los PMN en el SEVCS, cuando la aglutinación de los mismos se impide por pretratamiento con colchicina, por otro. La lisis de MCF-7 en el SEVCS tendría lugar de todas formas debido a su incompleta agregación con los PMN. Puede concluirse entonces que la falta de lisis de los PMN por el AMC FC-2.15 en circulación y, que por el contrario, las células tumorales Lewis˟-positivas sean eficientemente lisadas, son dos caracteristicas importantes que avalan el uso del AMC FC-2.15 en el tratamiento de tumores Lewis˟-positivos, sin riesgo de producir una lisis masiva de los PMN circulantes. Los resultados presentados indican que el AMC FC-2.15 podría ser útil en la inmunoterapia pasiva de pacientes con carcinomas Lewis˟-positivos, sin necesidad de conjugarlo con drogas ni toxinas.

Abstract:
In order to produce monoclonal antibodies (mAb)against antigens (Ags) expressed by breast carcinoma stem cells, nude mice were immunized with tumor epithelial cells from a human undifferentiated primary breast carcinoma. This strategy was followed in order to minimize the production of mAb directed against differentiation-associated Ags. A mAb designated FC-2.15 (IgM) was selected. FC-2.15 reacts with the majority of human breast primary tumors, independently of their histology and hormone receptor content. Moreover, FC-2.15 reacts with 80% of total breast malignant tumor cells and with 90% of proliferanting tumor cells. It recognizes other neoplasia such us colon carcinoma and chronic myeloid leukemia and, among the normal tissues examined, strong cross reactivity was found principally with peripheral granulocytes (PMN). Biochemical studies indicate that FC-2.15 recognizes the carbohydrate moiety of different glycoproteins. Anaysis of epitope specificity has demonstrated that FC-2.15 specifically recognizes terminally exposed Lewis˟ (Lex)(CD15) trisaccharide, but not sialyl Lex, Lewisª, trifucosylated Lewis y, blood group Ags A and B, globo H and gangliosides. FC-2.15 reactivity with different FC-2.15-positive tissues was analyzed by Western blot and characterized by enzymatic digestions (PNGaseF and Neuraminidase). In PMN, myeloid leukemic cells and colon carcinoma T-84 cells, Lewis˟ was found to be almost exclusively N-linked to the protein core, whereas in breast carcinoma MCF-7 cells, Lewis˟ appears to be mostly O-linked. Treatment with Neuraminidase increased detection by FC-2.15 in normal PMN, myeloid leukemic cells and T-84 cells but not in MCF-7 cells. It may be concluded that normal PMN and different tumor cells may express Lex and sialyl Lex residues in quite different proportions and be bound to different proteins. The relevance of Lex in normal and pathological conditions remains to be established. Several experiments were performed in order to characterize the interaction of FC-2.15 with PMN and MCF-7 cells both in vitro and in ex vivo circulating blood (EVCB), as an approach to in vivo conditions. In vitro, the binding of Lex-epitopes by FC-2.15 induces PMN homotypic aggregation. When PMN and Lex-positive MCF-7 cells are co-incubated, FC-2.15 induces heterotypic aggregation. In 51Cr-release assays employing human complement, FC-2.15 exerts a rapid and strong cytotoxic effect against PMN. However, when the effect of FC-2.15 was tested in EVCB, no lytic activity against PMN was detected, whereas MCF-7 cells were still lysed. Blood smears demonstrated that FC-2.15 induced PMN agglutination and heterotypic aggregates when MCF-7 cells were present. A pre-treatment of PMN with colchicine impaired PMN agglutination both in vitro and in EVCB. In the latter conditions FC-2.15 lytic activity was restored, suggesting that PMN homotypic aggregation by FC-2.15, but not lysis is dependent of microtubules integrity and that PMN agglutination hinders their lysis. Moreover, when the 51Cr-release assays were performed following agglutination, FC-2.15-cytotoxicity was restricted to isolated PMN. It may be concluded the lack of PMN lysis by FC-2.15 in circulation is reassuring, and since Lex-positive tumor cells are efficiently lysed. FC-2.15 could be useful to eliminate circulating Lex-positive tumor cells.

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Registro:
Título : Caracterización del anticuerpo monoclonal FC-2.15, dirigido contra carcinomas humanos y reactivo con LewisX : Estudio de sus propiedades funcionales in vitro y ex vivo     =    Characterization of monoclonal antibody FC-2.15, active against human carcinomas and reactive with Lewis*. In vitro and ex vivo functional properties studies.
Autor : Capurro, Mariana Isabel
Director : Mordoh, José
Año : 1999
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Fundación Campomar. Instituto de Investigaciones Bioquímicas (IIB)
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Químicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3153_Capurro
Idioma : Español
Area Temática : 
Palabras claves : ANTICUERPO MONOCLONAL FC-2.15; LEWIS*; CARCINOMAS; LEUCOCITOS POLIMORFONUCLEARES; INMUNOTERAPIA; NEUTROPENIA; MONOCLONAL ANTIBODY FC-2.15; LEWIS*; CARCINOMAS; NEUTROPHILS; NEUROTROPENIA; IMMUNOTHERAPY
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