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Ver el documento (formato PDF)   Labriola, Carlos Alberto.  "Purificación de la cruzipaína por cromatografía de afinidad : Su aplicación en el estudio del control de calidad del plegamiento de glicoproteínas en Trypanosoma cruzi"  (1999)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
Parte I: Purificación de cisteína proteinasas de trypanosomátidos por cromatografía de afinidad. Trypanosoma rangeli es un trypanosoma de América del sur capaz de infectar mamíferos pero aparentemente incapaz de causar patología. Tiene una alta reactividad inmunológica cruzada con Trypanosoma cruzi, el agante de la enfermedad de Chagas. La diferencia principal entre ambos parásitos parece ser la localización de las formas infectivas de T. rangeli en las glándulas salivales, comparada con la localización rectal de los trypomastigotes metacíclicos de T. cruzi, y la aparente pérdida de un estadío intracelular en el mamífero, en el caso del primer parásito. El último punto sugiere que algunos o todos de los diferentes factores postulados a estar involucrados en el reconocimiento, adherencia a, y penetración dentro de la célula de mamífero por los trypomastigotes de T. cruzi, podrían estar ausentes o fuertemente disminuidos en T. rangeli. Entre un número de factores de virulencia propuestos, la cruzipaína, cisteína proteinasa principal de T. cruzi ha sido descripta como una enzima esencial en distintos puntos del ciclo biológico del parásito y podría estar directamente involucrada en la penetración. Por esta razón, decidimos investigar actividades de cisteína proteinasa en epimastigotes de T. rangeli. Hemos purificado cruzipaína a homogeneidad proteica (de T. cruzi) y una cisteína proteinasa (de T. rangeli) utilizando cromatografía de afinidad, tanto en cistatina-Sepharosa, específica para cisteína proteinasas, como en concanavalina-A (ConA), específica para glicoproteínas con oligosacáridos de alta manosa, partiendo de extractos crudos de epimastigotes. La última enzima se expresa a un nivel de dos órdenes de magnitud menor que la cruzipaína en epimastigotes de T. cruzi. Ambas enzimas tienen masa molecular aparente, idéntica secuencia N-terminal y reacción inmunológica cruzada, pero difieren en la secuencia completa y en algunos parámetros cinéticos. Parte II: Control de calidad de plegamiento de glicoproteínas en Trypanosoma cruzi. Las N-glicoproteínas son al principio glicosiladas con la transferencia de un oligosacárido (Glc3Man9GlcNAc2, en la mayoría de las células) desde un derivado de dolicol-P-P a un residuo de Asn en el lúmen del retículo endoplásmico (RE). Los oligosacáridos unidos a proteína son procesados en la misma localización subcelular por la glucosidasa I (GI) que remueve la unidad de glucosa (Glc) mas externa y la glucosidasa II (GII) que remueve las dos glucosas remanentes. Un proceso adicional en el RE es la reacción catalizada por la UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (GT). Esta enzima agrega una unidad de Glc a oligosacáridos libres de glucosa en glicoproteínas que no presentan su plegamiento terciario correcto. La GII deglucosila los oligosacáridos monoglucosilados generados por la GT. Las glicoproteínas adquiren su estructura terciaria final en el RE. Las glicoproteínas que fracasan en adquirir su plegamiento correcto son retenidas en el RE y posteriormente transportadas al citosol donde son degradadas en el proteasoma. Por otro lado, las moléculas que se pliegan correctamente pueden continuar su tránsito a través del camino secretorio a su destino final. Se han descripto en el lúmen del RE, dos chaperones no convencionales, calnexina (Cnx) y calreticulina (Crt). Se ha demostrado que la interacción de la Cnx/Crt con glicoproteínas monoglucosiladas facilita el plegamiento de las glicoproteínas en células de mamíferos previniendo la agregación y la supresión de uniones disulfuro incorrectas. Mas aún, la interacción antes mencionada provee uno de los mecanismos por los cuales las células retienen en el RE glicoproteínas mal plegadas. Las interacción Cnx/Crt con glicoproteínas monoglucosiladas fue considerado por lo tanto, como un control de calidad de plegamiento de glicoproteínas. Este modelo predice que la inhibición de la remoción de la Glc agregada por la GT, retardaría (o aboliría) la salida de las glicoproteínas del RE. Esta predicción no puede ser comprobada, sin embargo, en la mayoría de las células dado que la GII es la responsable de la remoción de ambas unidades de Glc unidas en α(1,3). Mas aún, los inhibidores conocidos de GII también inhiben GI. La adición de estas drogas a las células lleva a la acumulación de oligosacáridos con dos o tres Glc que no son reconocidos por la Cnx/Crt. La predicción puede ser comprobada en T. cruzi. Este parásito transfiere “in vivo” oligosacáridos no glucosilados (Man9GlcNAc2) a los polipéptidos nacientes y, por lo tanto, los oligosacáridos monoglucosilados se forman en ellos solamente vía GT. La cruzipaína, una cisteína proteinasa lisosomal de T. cruzi, teniendo tres sitios potenciales de N-glicosilación, al menos dos de los cuales están ocupados, se aisló en la forma glucosilada de células crecidas en presencia de 1-deoxinojirimicina (DNJ), un inhibidor de la GI y GII. El oligosacárido presente en el único sitio de glicosilación del dominio carboxilo-terminal de la cruzipaína se glucosiló en algunas moléculas de enzima pero no en otras, este resultado es consistente con un plegamiento asincrónico de las glicoproteinas en el RE. A pesar de no afectar la velocidad de crecimiento celular o el metabolismo celular general en incubaciones cortas y largas, la DNJ causó un marcado retraso en el arribo de la cruzipaína a los lisosomas. Este resultado es compatible con el modelo propuesto por el cual las glicoproteinas monoglucosiladas podrían ser transitoriamente retenidas en el RE por anclas tipo lectinas reconociendo oligosacáridos monoglucosilados. También se encontró que este protozoo expresa una molécula tipo Crt, el tercer componente (además de GT y GII) del control de calidad de plegamiento de glicoproteínas. No se detectó un gen que codifique para Cnx. La Crt recombinante de T. cruzi reconoció especificamente oligosacáridos monoglucosilados del tipo alta manosa. El agregado de suero anti-Crt a extractos obtenidos de células de un experimento de “pulse-Chase” con Met más Cys inmunoprecipitó dos proteínas que fueron identificadas como Crt y cruzipaína. La última proteína pero no la primera desapareció durante el período de “chase”. Contrariamente a lo que sucede en células de mamíferos, la adición de DNJ promovió la interacción Crt-cruzipaína. Este resultado es consistente con la vía conocida de N-glicosilación de proteínas y procesamiento de oligosacáridos que ocurren en T. cruzi y explica el retraso en el arribo de la cruzipaína a los lisososmas causado por la DNJ. El tratamiento de los complejos Crt-cruzipaína con endo-β-N-acetilglucosaminidasa H (Endo H) tanto antes como después del agregado del suero anti-Crt abolió por completo la interacción Crt-cruzipaína. Además, la cruzipaína madura monoglucosilada pero no la no glucosilada aislada de los lisosomas interactuó con la Crt recombinante. Concluimos que la Crt de T. cruzi se une a oligosacáridos monoglucosilados pero no a motivos proteicos en la cruzipaína. Mas aún, las evidencias indican que la GT glucosiló a la cruzipaína en sus últimos estados de plegamiento.

Abstract:
Part I: Purification of cysteine proteinases of Trypanosomatids by affinity chromatography. Trypanosoma rangeli is a South American trypanosome able to infect mammals, but apparently unable to elicit pathology. lIt has a high immunological cross-reactivity with Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas disease. The major differences between both parasites seem to be the salivary gland location of the infective forms of T. rangeli, as compared with the rectal localization of the metacyclic trypomastigotes of T. cruzi, and the apparent lack of an intracellular stage in the mammal, in the case of the former parasite. The latter point suggest that some or all of the different factors postulated to be involved in recognition, adherence to, and penetration into the mammalian cell by T. cruzi trypomastigotes might be absent or strongly diminished in T. rangeli. Among a number of proposed virulence factors, cruzipain, the major cysteine proteinase of T. cruzi has been implied as an essential enzyme in several points of the biological cycle of the parasite, and may also be directly involved in penetration. For this reason, we decided to search for cysteine proteinase activities in epimastigotes of T. rangeli. We have purified to protein homogeneity cruzipain (from T. cruzi) and a cysteine proteinase (from T. rangeli), using affinity chromatography, both on cystatin-Sepharose, specific for cysteine proteinases, and ConA-Sepharose, specific for high mannose type N-linked glycoproteins, starting from crude epimastigote extracts. The latter enzyme is expressed at a level at least two orders of magnitude lower than is cruzipain in T. cruzi epimastigotes. Both enzymes have similar apparent molecular mass and identical N-terminal sequence, and cross-react immunologicaly, but differ in full sequence and in some kinetic parameters. Part II: The quality control of glycoprotein folding in Trypanosoma cruzi. N-glycoproteins are first glycosylated upon transfer of an oligosaccharide (Glc3Man9GlcNAc2 in most cells) from a dolichol-P-P derivative to Asn residues in the lumen of the endoplasmic reticulum (ER). Protein-linked oligosaccharides are then processed in the same subcellular location by glucosidase I (GI) that removes the more external glucose (Glc) unit and glucosidase II (GII) that excises the two remaining Glc. An additional ER processing reaction is that catalyzed by the UDP-Glc:glycoprotein glucosyltransferase (GT). This enzyme adds a single Glc unit to Glc-free, high mannose-type oligosaccharides in glycoproteins not displaying their properly folded tertiary structures. GII deglucosylates the monoglucosylated oligosaccharides generated by GT. Glycoproteins acquire their proper tertiary structure in the ER. Glycoproteins that fail to properly fold are retained in the ER and further transported to the cytosol where they are degraded in the proteasomes. On the other hand, properly folded species may continue their transit through the secretory pathway to their final destinations. Two unconventional chaperones calnexin (Cnx) and calreticulin (Crt), have been described in the ER lumen of mammalian cells. It has been shown that interaction of Cnx/Crt with monoglucosylated glycoproteins facilitates glycoprotein folding in mammalian cells by preventing aggregation and suppressing formation of non-native disulfide bonds. Moreover, the above mentioned interaction provides one of the mechanisms by which cells retain misfolded glycoproteins in the ER. The Cnx/Crt interaction with monoglucosylated glycoproteins has been considered to be, therefore, a quality control of glycoprotein folding. This model predicts that inhibition of removal of the Glc unit added by GT would delay (or abolish) exit of glycoprotein from the ER. This prediction can not be tested, however, in most eukaryotic cells as GII is responsible for removal of both α(1,3) linked Glc units. Moreover, known inhibitors of GII also inhibit GI. Addition of those drugs to cells leads to the accumulation of oligosaccharides having two or three Glc that are not recognized by Cnx/Crt. The prediction can be tested in T. cruzi. This parasite transfers “in vivo” unglucosylated oligosaccharides (Man9GlcNAc2)to nascent polypeptide and, therefore, monoglucosylated oligosaccharides are formed in them only by GT. Cruzipain, a T. cruzi lysosomal cysteine proteinase having three potential N-glycosilation sites, at least two of which are occupied, was isolated in a glucosylated form from cells grown in the presence of the GI and GII inhibitor 1-deoxynojirimycin (DNJ). The oligosaccharide present at the single glycosylation site of the carboxy-terminal domain of cruzipain was glucosylated in some enzyme molecules but not in others, this result being consistent with an asyncronous folding of glycoproteins in the ER. In spite of not affecting cell growth rate or the cellular general metabolism in short and long term incubation, DNJ caused a maeked delay in the arrival of cruzipain to lysosomes. This results is compatible with the model proposed by which monoglucosylated glycoproteins may be transiently retained in the ER by lectin-like anchors recognizing monoglucosylated oligosaccharides. It was found also that this protozoan expresses a Crt-like molecule, the third component (in addition to GT and GII) of the quality control of glycoprotein folding. No Cnx-encoding gene was detected. Recombinant T. cruzi calreticulin specifically recognized free monoglucosylated high mannose-type oligosaccharides. Addition of anti-Crt serum to extracts obtained from cells pulse-chased with Metplus Cys immunoprecipitated two proteins that were identified as Crt and the lysosomal proteinase cruzipain. The latter but not the former protein disappeared upon chasing cells. Contrary to what happens in mammalian cells, addition of DNJ promoted Crt-cruzipain interaction. This result is consistent with the known pathway of protein N-glycosylation and oligosaccharide processing occurring in T. cruzi and explains the delay in cruzipain arrival to lysosomes caused by DNJ. A treatment of the Crt-cruzipain complexes with endo-β-N-acetylglucosaminidase H (Endo H) either before or after addition of anti-Crt serum completely disrupted Crt-cruzipain interaction. In addition, mature monoglucosylated but not unglucosylated cruzipain isolated from lysosomes was found to interact with recombinant Crt. It was concluded that T. cruzi Crt binds monoglucosylated oligosaccharides but not the protein moiety of cruzipain. Furthermore, evidence is presented indicating that GT glucosylated cruzipain at its last folding stages. Journal of Cell Biology 130, N° 4 (1995) 771-

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Registro:
Título : Purificación de la cruzipaína por cromatografía de afinidad : Su aplicación en el estudio del control de calidad del plegamiento de glicoproteínas en Trypanosoma cruzi    
Autor : Labriola, Carlos Alberto
Director : Cazzulo, Juan José
Director Asistente : Parodi, Armando José
Año : 1999
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Fundación Campomar. Instituto de Investigaciones Bioquímicas
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Químicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3162_Labriola
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Parasitología
Química / Química Biológica
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