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Ver el documento (formato PDF)   Vazquez Rovere, Cecilia.  "Análisis del mecanismo de resistencia a la infección viral mediado por la expresión del ORF2b de PLRV en plantas transgénicas de Solanum tuberosum"  (2000)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
La expresión de secuencias nucleotídicas codificantes para replicasas virales en plantas transgénicas fue propuesta como un sistema eficiente para conferir resistencia contra enfermedades provocadas por virus induciendo mecanismos de protección en la planta. Una de las primeras enfermedades para las cuales este tipo de protección fue ensayado en plantas de papa, es la provocada por el virus del enrollamiento de la hoja de papa (PLRV). Sin embargo, no se describieron aún detalles sobre el mecanismo de protección. El marco de lectura abierto 2b (ORFZb) de un aislamiento argentino de PLRV fue clonado y secuenciado encontrándose un 94% y 97% de homología con las secuencias nucleotídicas de aislamientos de origen australiano y holandés, respectivamente. Con el fin de elucidar el mecanismo de protección contra las infecciones de PLRV, se construyeron tres versiones del ORF2b (no-traducible en orientación sentido, traducible en orientación sentido con el agregado del codón ATG en fase de traducción y una versión en orientación antisentido) y fueron introducidas en plantas de papa (cv Kennebec) por transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens. Con las plantas transgénicas resultantes se realizaron ensayos de infección por injertos que mostraron que con cualquiera de las construcciones fue posible obtener líneas transgénicas resistentes, sugiriendo que el mecanismo de protección es independiente de la expresión de la proteína y es mediado por el RNA. No existió correlación entre el grado de metilación o el número de copias del transgén presentes en las líneas transgénicas y el nivel de protección. Los ensayos de infección natural a campo confirmaron la obtención de líneas transgénicas resistentes. También se realizaron experimentos de transformación transitoria mediante biolística de hojas derivadas de plantas transgénicas utilizando vectores que codifican proteínas de fusión GUS::ORF2b, seguidas de la visualización del nivel de la expresión del gen reportero. Los resultados apoyan la hipótesis de protección mediada por un mecanismo de silenciamiento post-transcripcional del gen de la replicasa. Con el objetivo de obtener plantas transgénicas simultáneamente resistentes al virus Y de la papa (PVY) y al PLRV se construyó una única construcción que expresa la proteína de cápside del virus del mosaico de la lechuga (LMV) y el gen de la replicasa de PLRV. Se obtuvieron plantas de papa (cv Kennebec) transgénicas por transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens que fueron evaluadas en ensayos en condiciones controladas de invernadero desafiándolas con áfidos virulíferos e inoculación mecánica de PVY. Se encontró que 17/27 líneas transgénicas independientes exhibieron inmunidad a PLRV, 12/27 mostraron ausencia de infección con PVY y 8/27 líneas exhibieron inmunidad a ambos virus resultando buenas candidatas para los próximos ensayos de campo. Finalmente, con el fin de obtener plantas de papa simultáneamente resistentes a infecciones virales y fúngicas, se realizaron ensayos de co-transformación utilizando la construcción descripta en el párrafo anterior y el vector pZP-RIP-CHI capaz de expresar los genes de quitinasa y rip provenientes de cebada. Algunas de las plantas transgénicas múltiples fueron ensayadas en invernadero para determinar la resistencia a infecciones producidas por PVY y PLRV y evaluar protección a Rhizoctonia solani. Se encontró al menos una línea que revela gran resistencia a las infecciones virales y una protección aumentada a los ataques de los hongos. Resulta necesaria una evaluación más exhaustiva tanto de ésta como de todas las líneas seleccionadas en este trabajo, en condiciones naturales de infección a campo considerando no sólo la resistencia sino la performance agronómica y la preservación de la identidad del cultivar.

Abstract:
Genetically engineered expression of replicase encoding sequences has been proposed as an efficient system to confer protection against virus diseases by eliciting protection mechanisms in the plant. Potato leaf-roll was one of the first diseases for which this kind of protection was engineered in potato plants. However, details of the protecting mechanism were not reported, so far. The ORF2b of an Argentinean strain of potato leafroll virus (PLRV) was cloned and sequenced finding 94% and 97% of homology with Australian and Netherlander strains, respectively. To elucidate the mechanism of protection against PLRV infection, three versions of ORF2b (non-translatable sense, translatable sense with an engineered ATG and antisense) were constructed under the control of the 35S CaMV promoter and the nos terminator and introduced in potato plants (cv. Kennebec) by Agrobacteríum tumefaciens mediated transformation. Grafting infection experiments showed that resistant transgenic plants could be obtained with any of the constructs, suggesting that the mechanism of protection is independent of the expression of protein and RNA mediated. Neither DNA methylation, nor the number of transgene copies present in the transgenic lines correlated with protection. Field trial infection confirmed that resistant transgenic events were obtained. Biolistic transient transformation experiments of leaves derived from transgenic plants using a gene coding for the fusion protein GUS::ORF2b, followed by scoring of the number of GUS expressing leaf spots, supported that the protection is mediated by a post-transcriptional gene silencing mechanism. Several examples of transgenic plants carrying particular sequences able to confer protection against virus diseases were published. However, there are very few published cases of combined resistance and there are no published evidences on the simultaneous protection using only one genetic construct that elicits two different protection mechanisms. As it was previously described, potato plants that were transformed with PLRV replicase coding sequence exhibit resistance against virus infection mediated by a post-transcriptional gene silencing mechanism. Likewise, the expression of the coat protein coding sequence of Lettuce Mosaic Virus (LMV) conferred heterologous protection in tobacco Xanthi against several strains of potato virus Y (PVY). In this work a double construct carrying the LMV coat protein and PLRV replicase gene was constructed and introduced in potato plants (cv. Kennebec) by Agrobacterium tumefaciens mediated transformation. Greenhouse assays challenging transgenic plants with viruliferous aphids or mechanic inoculation were conducted and seventeen (out of twenty seven independent lines) exhibited immunity to PLRV, twelve of them showed absence of PVY replication and eight lines exhibiting immunity to both virus are very promising candidates for future field trials. Significant yield losses due to fungal attack limits crop productivity and can be very severe in local epidemic infections. To obtain multiple transgenic potato plants simultaneously resistant to virus and fungal infections we carried out co-transformation assays using the construct described above and the pZP-RIP-CHI vector carrying barley class-II chitinase and rip genes. Some of the multiple transgenic plants were assayed in greenhouse for PVY and PLRV infection resistance and for Rhizoctonia solani protection and we found one line that revealed high resistance to virus and enhanced protection against fungal attack.

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Registro:
Título : Análisis del mecanismo de resistencia a la infección viral mediado por la expresión del ORF2b de PLRV en plantas transgénicas de Solanum tuberosum    
Autor : Vazquez Rovere, Cecilia
Director : Hopp, Horacio Esteban
Año : 2000
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) Castelar. Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias (CNIA). Instituto de Biotecnología
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3263_VazquezRovere
Idioma : Español
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