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Ver el documento (formato PDF)   Cremona, María Laura.  "TRANS-SIALIDASA en Trypanosoma cruzi: estudio de la estructura y función de esta familia de antígenos de superficie"  (2000)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
La enfermedad de Chagas es una de las parasitosis endémicas más importantes de América. Dieciocho millones de personas infectadas releva un informe reciente de la Organización Mundial de la Salud (WHO, 1998). Tryparzosoma cruzzi es el parásito responsable de esta enfermedad. Presenta en su superficie la trans-sialidasa, una enzima unida a la membrana por un enlace glicofosfatidilinositol. Esta enzima le otorga la capacidad de adquirir ácido siálico a partir de sialiglicoconjugados del organismo que infecta, ya que T cruzles incapaz de sintetizar este monosacárido. La trans-sialidasa fue involucrada en aspectos clave de la infección y la supervivencia del parásito en sangre. La familia de proteínas de la trans-sialidasa está codificada por al menos 140 genes que pueden clasificarse en tres sub-familias de acuerdo a la estructura y la función de sus productos proteicos. Dos de estos grupos son expresados en tripomastigotes, la forma infectiva del parásito, y se distinguen en su capacidad de trans-glicosidar: las trans-sialidasas activas y las trans-sialidasas inactivas. La comparación de la secuencia de la región N-terminal de proteínas de ambos grupos permitió deducir que la sustitución Tyr-His en la posición 342 de la proteína madura determina su capacidad de actuar como trans-sialidasa. Esta tirosina es imprescindible para que la molécula pueda actuar como enzima y su reemplazo por histidina, residuo presente en los integrantes de la familia sin actividad enzimática, determina la pérdida total de la capacidad trans-glicolítica. Además de la Tyr342,otro aminoácido, Pro231, también es necesario para la actividad enzimática: el cambio Pro231Ala resulta en una trans-sialidasa parcialmente activa con respecto a la enzima natural. Se examinó la capacidad de las proteínas inactivas para unir ácido siálico y galactosa en un ensayo de aglutinación y se comprobó que las trans-sialidasas enzimáticamente inactivas aglutinan glóbulos rojos desialidados que presentan betagalactosas terminales, la misma especificidad que requiere la enzima. La trans-sialidasa podría definirse como una sialidasa particular. En lugar de hidrolizar ácido siálico lo transfiere preferencialmente a beta-galactosas terminales presentes en glicoproteínas y glicolípidos y difiere de las sialil y glicosil-transferasas conocidas en que no requiere un nucleótido-azúcar como dador. De los 16 aminoácidos que constituyen el sitio activo de la sialidasa de Salmonella typhimurium, 14 aminoácidos, incluyendo la Tyr342, están presentes en las mismas o en similares posiciones en la estructura primaria de la trans-sialidasa. Tryparzosoma rangeli, parásito de origen americano no patógeno para el hospedador humano, libera al medio una sialidasa cuya secuencia primaria es 70 % homóloga a la trans-sialidasa de T. cruzi La estructura cristalográfica de la sialidasa obtenida en nuestro laboratorio permitió obtener el modelo de la trans-sialidasa. La comparación de ambas estructuras permitió la identificación de unos pocos aminoácidos que modularían la actividad de transferencia. Los experimentos de mutagénesis dirigida sugirieron la presencia de un sitio distinto de unión para el carbohidrato aceptor del grupo sialilo, y una probable diferencia en la arquitectura de ambos sitios activos.

Abstract:
Trypanosoma cruzzi is the protozoan haemoflagelate responsible for Chagas’ disease, which affects almost 18 million people in America, as reported recently by the World Health Organization (WHO, 1998). T. cruzzi trypomastigotes acquire sialic acid from host glycoconjugates by means of a plasma membrane associated trans-sialidase, as it is unable to synthesize this sugar. This enzyme differs from all other known sialyl- and glycosyl- transferases in that it does not require a nucleotide sugar as donor. It has been involved in key aspects of parasite’s infection and survival. This enzyme belongs to a large family of proteins encoded by at least 140 genes. These proteins contain the enzymatic region at the N-terminus, the only one required for trans-sialidase activity and an antigenic domain on the C-terminus. Some members of the family lack the enzymatic activity. Gene encoding inactive members are not a few, but rather are present in the same copy number, 60-80 per haploid genome, as those encoding active trans-sialidase. The complete sequences of the enzymatic region of active an inactive members were compared and it showed a limited divergence among them: 20 out of the 642 amino acids in the region were found to differ. From these 20 amino acids, only one was found to be essential for enzymatic activity. A Tyr residue at position 342 of the mature protein is deduced in active proteins while an His at the same position is present in inactive ones. This naturally occurring Tyr324His substitution completely abolished trans-sialidase activity. In addition to Tyr, a second amino acid, Pro231, was found to be necessary for full enzymatic activity. A Pro231Ala change rendered the trans-sialidase protein partially active. Recombinant inactive proteins were purified and assayed for sialic acid and galactose binding activity in agglutination tests. The enzymatically inactive trans-sialidases were found to agglutinated de-sialilated erythrocytes but not untreated red blood cells. Assays made with mouse and rabbit red blood cells suggest that inactive trans-sialidases bind to beta, rather than alpha terminal galactoses, the same specificity required by active trans-sialidases. At least some molecules in the trans-sialidase family that have lost their enzymatic function still retain their Gal-binding properties and might have a function as lectins in the parasite-host interaction. The trans-sialidase could be defined as a particular sialidase that, instead of hydrolyzing sialic acid, it preferentially transfers the monosaccharide to a terminal beta-galactose in glycolipids and glycoproteins. Fourteen amino acids residues, including Tyr342, out of the 16 amino acids that build the active site of the sialidase from Salmonella typhymurium, are present at the same or similar positions in the primary structure of trans-sialidase. The crystal structure of the sialidase from the closely related American trypanosome T. rangeli allowed the modeling of T. cruzi trans-sialidase. Comparison of these structures allowed the identification of few amino acids that may modulate transferase activity. Mutagenesis experiments suggest the presence of a distinct binding site for the acceptor carbohydrate and different arquitectural arrangements of both active sites.

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Registro:
Título : TRANS-SIALIDASA en Trypanosoma cruzi: estudio de la estructura y función de esta familia de antígenos de superficie     =    Trans-sialidase in Trypanosoma cruzi : study of the structure and function of this family of surface antigens
Autor : Cremona, María Laura
Director : Frasch, Alberto Carlos C.
Año : 2000
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Fundación Campomar
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Químicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3264_Cremona
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Parasitología
Biología / Biología Molecular y Celular
Química / Química Biológica
Palabras claves : TRANS-SIALIDASA; NEURAMINIDASA; SITIO CATALITICO; FAMILIA DE GENES; ENFERMEDAD DE CHAGAS; INTERACCION PARASITO-HOSPEDADOR; TRANS-SIALIDASE; NEURAMINIDASE; GENE FAMILY; ACTIVE SITE; CHAGAS DISEASE; HOSTPARASITE INTERACTION
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