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Ver el documento (formato PDF)   López-Malo Vigil, Aurelio.  "La preservación multiobjetivo de alimentos: Efecto de factores tradicionales y emergentes en la respuesta de Aspergillus flavus"  (2000)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
El objetivo de esta tesis fue evaluar el efecto de la interacción de distintos factores de estrés (aw, pH, antimicrobianos sintetizados químicamente o antimicrobianos naturales y sus mezclas binarias) en la respuesta de crecimiento de Aspergillus flavus y determinar las condiciones de combinación inhibitorias sinérgicas o de cooperación de dichos factores, con miras a generar modelos predictivos para la conservación multiobjetivo de alimentos. Se determinó el efecto de distintas combinaciones de factores de estrés, tales como actividad de agua (0,99 o 0,95), pH (4,5 o 3,5) y presencia de antimicrobianos sintetizados artificialmente (benzoato de sodio, bisulfito de sodio o sorbato de potasio) y/o antimicrobianos naturales (vainillina, eugenol, carvacrol, timol o citral) sobre la respuesta de crecimiento de Aspergillus flavus. Se formularon sistemas modelo tomando como medio base al agar papa-dextrosa adicionando las cantidades necesarias de sacarosa y ácido clorhídrico para ajustar la actividad de agua y el pH según el caso y adicionando desde 100 hasta 1,800 ppm de los antimicrobianos en forma individual o en combinaciones binarias de los antimicrobianos. En cada caso los medios sólidos fueron inoculados con 2 μL de una suspensión de esporas del moho y se registró el tiempo para detectar el inicio del crecimiento de la colonia y/o su cambio en diámetro en función del tiempo de incubación. En los sistemas formulados con algún agente antimicrobiano y donde el moho se desarrolló, la velocidad de crecimiento radial varió de 0,037 (a.w 0,95; pH 3,5; 500 ppm eugenol) a 0,609 mm/h (aw 0,99; pH 4,5; 100 ppm benzoato de sodio). El tiempo lag se incrementó conforme aumentó la concentración del agente antimicrobiano, por ejemplo, el tiempo lag se alargó aproximadamente 330 horas (cerca de 14 días) en medios formulados con 200 ppm de timol, aw 0,99 y pH 3,5 y con 300 ppm de este agente el tiempo para detectar la presencia del moho se retraso 1400 horas (más de 55 días). Se determinaron las concentraciones mínimas inhibitorias de antimicrobianos comunes y naturales para Aspergillus flavus, mostrándose cuando se utilizó benzoato de sodio, bilsulfito de sodio o sorbato de potasio, una dependencia en el valor de pH, y esta dependencia fue más notoria a valores de aw altos (0,99). A valores de aw bajos (0,95), se observó la interacción de la presencia de 300 ppm sorbato de potasio y un pH de 4,5 en la inhibición del moho. El sorbato de potasio junto con carvacrol y timol fueron los antimicrobianos más efectivos para esta combinación aw- pH. Se modeló utilizando el modelo de Fermi la respuesta a la dosis (cantidad de agente antimicrobiano) para todas las combinaciones antimicrobiano - pH - aw evaluadas. La respuesta del moho se expresó como el cociente entre el tiempo lag con respecto al tiempo lag del sistema control mostrando la típica forma sigmoide de las curvas de respuesta a la dosis. Se observaron diferencias importantes en los valores de los coeficientes de la fución de Fermi (Pc y k) para los diferentes agentes antimicrobianos, así como para los distintos valores de aw y pH evaluados. Los resultados mostraron que las concentraciones de los agentes antimicrobianos naturales necesarias para duplicar el tiempo lag que se obtiene en el sistema control no dependen tanto del pH del sistema, como en el caso de los agentes antimicrobianos sintéticos. Se determinó la interacción entre los distintos factores cuando se aplicaron en distintos niveles sobre la interferencia de la homeostasis de Aspergillus flavus y se determinaron condiciones sinérgicas o de cooperación para la inhibición y retraso en el crecimiento del moho, evaluando la respuesta de Aspergillus flavus a diferentes mezclas binarias de antimicrobianos comunes y naturales. No se observó crecimiento del moho a tiempos de incubación largos conforme se aumentó la concentración de los agentes antimicrobianos en la mezcla. Se observaron también importantes diferencias en el comportamiento del moho en los medios formulados con distinto valor de pH, así como entre las diferentes mezclas de agentes antimicrobianos. Las mezclas de los distintos agentes retrasaron el crecimiento al menos 5 días en muchos de los casos, resaltando el comportamiento de las mezclas con citral en donde se observó que en el 58% de los casos (274 de un total de 474) a pH 3,5 y en el 53% (253 de 474) a pH 4,5 las observaciones fueron de no crecimiento después de 5 días y de crecimiento a los 30 días de incubación. Cada uno de los resultados de las observaciones del crecimiento o no crecimiento de Aspergillus flavus se representaron mediante un isobolograma, utilizando para las diferentes condiciones de pH (4,5 o 3,5) y períodos de incubación(5, 10, 15 o 30 días), las concentraciones fraccionales inhibitorias (CFI) de cada agente en la mezcla. Los CFI índices (calculados como la suma de los CFI de cada agente en la mezcla) para las combinaciones de agentes antimicrobianos evaluados después de 30 días de incubación, variaron de 0,125 (pH 4,5; 50 ppm timol y 800 ppm vainillina) a 1,764 (pH 3,5; 1600 ppm citral y 50 ppm timol). Los CFI índices mostraron comportamientos de sinergismo, aditividad o antagonismo dependiendo de los agentes y sus niveles en las diferentes mezclas, y también del tiempo de incubación. Se realizaron experimentos que permitieron el modelado matemático (probabilístico) de la interfase entre crecimiento y no-crecimiento de Aspergillus flavus bajo diferentes condiciones de actividad de agua (0,98; 0,96 o 0,94), pH (5,0; 4,0 o 3,0), temperatura de incubación (15 o 25°C) y concentración (0, 200, 400, 600, 800 o 1000 ppm) de benzoato de sodio o vainillina. Los resultados se interpretaron utilizando modelos predictivos con miras a ser utilizados en la conservación multiobjetivo de alimentos, evaluando la supervivencia del moho a los diferentes factores y prediciendo las condiciones letales y/o inhibitorias. Se observó un efecto importante del tiempo de incubación, ya que combinaciones inhibitorias del crecimiento del moho a tiempos cortos resultaron positivas (crecimiento) con tiempos de incubación más prolongados, demostrando el efecto sobre el tiempo lag de A. flavus de los factores empleados en las distintas combinaciones estudiadas. Utilizando regresión logística se obtuvo un modelo polinomial con alto porcentaje de concordancia entre los datos (>93%) además las pruebas de Hosmer y Lemeshow y de Chi-cuadrado dieron resultados significativos, lo que demuestra la bondad en el ajuste del modelo propuesto para predecir la respuesta (probabilidad de crecimiento) de Aspergillus flavus. El modelo permitió calcular la probabilidad de crecimiento del moho cuando fue inoculado en medios formulados con distintos valores de aw, pH, concentraciones de benzoato de sodio o vainillina e incubado por diferentes tiempos a distintas temperaturas. Se observó que la probabilidad de crecimiento del moho disminuyó conforme disminuyó la temperatura de incubación, el pH y la aw y conforme aumentó la concentración de los agentes antimicrobianos. La probabilidad de que el moho se desarrollara fue menor en los casos en los que el medio contenía benzoato de sodio. El modelo logístico permitió predecir la respuesta del moho bajo diferentes combinaciones de las variables si se establecía un nivel de probabilidad para que el evento (crecimiento) ocurriera. Al disminuir el valor de probabilidad los niveles de las variables empleadas en la combinación deberían ser más severos; menor temperatura de incubación, menor pH, menor aw, mayor concentración de agente antimicrobiano o menor tiempo de incubación o el uso de vainillina como antimicrobiano, para asegurar con esa probabilidad que el evento ocurriera (o con el complemento de la probabilidad que el evento no ocurriera).

Abstract:
The objective of this research was to evaluate the effects of several microbial stress factors interactions (aw, pH, chemical synthesized antimicrobials or natural antimicrobials and their mixtures) in the growth response of Aspergillus flavus and to determine those combinations and conditions that cause a synergic inhibition and permit modeling and predicting of mold response within a multitarget preservation of foods approach. The effects of several combinations of microbial stress factors such as water activity (0,99 or 0,95), pH (4,5 or 3,5) and the presence of synthetic antimicrobials (sodium benzoate, sodium bisulfite or potassium sorbate) or naturally occurring antimicrobials (vanillin, eugenol, thymol, carvacrol or citral) on Aspergillus flavus growth response were evaluated. Potato dextrose agar was adjusted with the necessary quantities of sucrose and chlorhydric acid to attain aw and pH. l00, 200, 300 up to 1,800 ppm of individual or combinations of each antimicrobial agent were incorporated to the agar. Each formulated and solidified media was inoculated with 2 μL of A. flavus spore suspension and time to growth and/or colony diameter was recorded as a function of incubation time. In those systems formulated with antimicrobial agents and where mold growth was observed, radial growth rate ranged from 0,037 (aw 0,95; pH 3,5; 500 ppm eugenol) to 0,609 mm/h (aw 0,99; pH 4,5; 100 ppm sodium benzoate). Lag time increased as antimicrobial agent concentration in the agar increased, in media containing 200 ppm thymol, aw 0.99 and pH 3.5 lag time was around 330 h (l4 days), with 300 ppm of the same phenolic compound the time to detect a visible colony was delayed around l400 h (55 days). Synthetic and natural antimicrobial minimal inhibitory concentrations to Aspergillus flavus, indicated that the use of sodium benzoate, sodium bisulfite or potassium sorbate were pH dependent, being more noticeable at aw 0,99. At aw 0,95, an interaction between 300 ppm potassium sorbate and pH 4,5 to inhibit mold growth was observed. Potassium sorbate, carvacrol and thymol were the most effective antimicrobials tested in this aw—pH combination. Using Fermi function, dose response models for each antimicrobial were obtained in each pH-aw combination. Mold growth response was expressed as the ration between the lag time with respect the lag time obtained in the control media without antimicrobial, showing typical sigmoid form of dose response curves. Important differences in Fermi function parameters (Pc y k) were observed depending the type of antimicrobial, aw and pH. The model demonstrated that natural antimicrobial concentration needed to duplicate lag time as compared with A. flavus lag time in the control a lesser pH dependence than the observed with synthetic antimicrobials. An interaction between pH, aw and antimicrobial agent concentration on mold growth response. Homeostatic Aspergillus flavus interference due to interactions of stress factors and selected levels were evaluated in order to determine synergic situations that inhibit mold growth. Several binary combinations of natural and synthetic antimicrobials were tested against mold spore in model systems. At short incubation times A. flavus was unable to grow but with longer incubation times higher antimicrobial concentration were needed to inhibit growth. Mold respond in a different way depending on pH and antimicrobial type and concentration. In many of the tested combinations no growth was observed after 5 days of incubation. Mold inoculated in media formulated with antimicrobial mixtures containing citral show a special behavior. 58% of the evaluated cases (274 of a total of 474) at pH 3,5 and in 53% (253 of 474) at pH 4,5; no growth was observed after 5 days and growth was observed after 30 days of incubation. Each growth or no growth result obtained at pH 3,5 or 4, 5 and after 5, 10, 15 or 30 days of incubation, was transformed into fractional inhibitory concentrations (FIC) and an isobologram plot was constructed for each evaluated antimicrobial mixture. FIC was calculated as the inhibitory concentration of each antimicrobial in the presence of the other divided by the individual inhibitory concentration. Isoblograms as well as FIC index show that values near to 1 represent additivity, values lower than 1 represent synergy and values higher than 1 represent antagonism. Calculated FIC index for 30 days of incubation ranged from 0,125 (pH 4,5; 50 ppm thymol and 800 ppm vanillin) to 1,764 (pH 3,5; 1600 ppm citral and 50 ppm thymol). FIC index presented synergy, additivity or antagonism depending of the antimicrobials mixed and their level in the mixture. Several experiments were carried out to mathematically model (probabilistic) Aspergillus flavus growth —no growth interface when inoculated in media formulated with selected water activity (0,98; 0,96 or 0,94), pH (5,0; 4,0 or 3,0), incubation temperature (15 or 25°C) and antimicrobial agent concentrations (0, 200, 400, 600, 800 o 1000 ppm) of sodium benzoate or vanillin. The results were interpreted using predictive equations that permit to describe and predict multi-target preservation of foods by using mold survival as a model. Incubation time has an important effect on mold inhibition, several inhibitory factor combinations inhibit mold growth for 100—200 h of incubation but with longer incubation times mold grew, demonstrating the effect of the evaluated factors on mold lag time. Using logistic regression a polynomial equation was obtained with a higher than 93% of concordance between observed and predicted data. Hosmer and Lemeshow and Chi-square tests were significant indicating the goodness of fit of the model and its adequacy to predict the probability of growth. The model permitted to calculate mold probability of growth when inoculated in media formulated with selected aw and pH values selected concentrations of sodium benzoate or vanillin and incubated at different temperatures for different times. The probability of growth diminished as incubation temperature, pH and aw decreased and as antimicrobial concentration increased. Lower probability of growth was obtained in those factor combinations that included sodium benzoate as antimicrobial than in those containing vanillin. The logistic model permitted to predict the probability of growth under several combinations and also permitted to calculate the levels of the variables in the combination if a tolerable probability level is pre-established. As the probability diminished, the levels of the variables in the combination were more severe, lower incubation temperature, lower pH, lower aw, greater antimicrobial concentration or shorter incubation time.

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Registro:
Título : La preservación multiobjetivo de alimentos: Efecto de factores tradicionales y emergentes en la respuesta de Aspergillus flavus     =    Multitarget preservation of foods : Aspergillus flavus response to traditional and emergent factors
Autor : López-Malo Vigil, Aurelio
Director : Alzamora, Stella Maris
Año : 2000
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Industrias
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3294_LopezMaloVigil
Idioma : Español
Area Temática : Ciencia y Tecnología de los Alimentos / Conserva Alimenticia
Biología / Micología
Palabras claves : CONSERVACION DE ALIMENTOS; MICROORGANISMOS DETERIORATIVOS; ASPERGILLUS FLAVUS; MICROBIOLOGIA PREDICTIVA; ANTIMICROBIANOS NATURALES; FOOD PRESERVATION; SPOILAGE MICRORGANISMS; ASPERGILLUS FLAVUS; PREDICTIVE MICROBIOLOGY; NATURAL ANTIMICROBIALS
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