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Ver el documento (formato PDF)   Cadenas, María Belén.  "Mecanismos de señalización inducidos por el factor de crecimiento y transformación Beta 1 (TGF beta sub 1), en fibroblastos de ratón Swiss 3T3"  (2000)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
La superfamilia del TGFβ está formada por polipéptidos que regulan diferencialmente la división celular, en mamíferos. Dependiendo del tipo celular, el TGFβ1 puede inhibir, promover o potenciar la división celular. En monocapas confluentes y aquietadas de la línea celular Swiss 3T3, el TGFβ1 (O,5—2 ng/ml) no induce, ni inhibe la proliferación celular. Sin embargo, este factor es capaz de potenciar la proliferación inducida por la PGF2α (300 ng/ml) . De las señales activadas por la PGF2α, se buscó cúales eran las más importantes en la sinergia con el TGFβ1. Se comenzó estudiando la quinasa C (PKC), a través de la retromodulación con 12-tetradecanoilforbol l3-acetato (TPA, 800 nM, 96 hs.), o Briostatina l (lOO nM, 96 hs.). En la condición de retro-modulación de la PKC, se observó que el TGFβ1 (1,0 ng/ml) era capaz de inducir la proliferación celular (50 % de células en fase S, después de 28 hs. de estimulación, y 50 % de aumento en el número de células, después de 48 hs. de estimulación), siendo ésta dependiente, tanto de la concentración del factor, como de la concentración de los compuestos que retro-modulan la PKC. En las células pretratadas con TPA, la fase G1 tiene unas 6 a 7 horas más, que en las células sin pretratar. En la primer condición, el TGFβ1 induce la expresión de la ciclina D1, y en correlación a la mayor duración de la fase G1, ocurre horas más tarde después de la estimulación (lO-12 hs.), comparado con las células sin pretratar, estimuladas con PGF2α (6-9 hs.) . Fue interesante observar, que la PGF2α, induce la expresión de la ciclina Dl, en células pretratadas con TPA, aún cuando en esta condición no es mitogénica, y a pesar que la CDK4 se halle presente. Este resultado lleva a plantear que la expresión de la ciclina Dl, no necesariamente indica que la célula se dividirá, y además que es independiente de la PKC. Con el uso del anticuerpo monoclonal anti PKCα , se observó que esta enzima está ausente en el momento de agregado el TGFβ1, en células pretratadas con TPA. La inhibición directa de la PKC con el inhibidor específico GF 109203X (1O μM), agregado una hora antes a células sin pretratar, no fue suficiente para permitir que el TGFβ1 indujera la mitogénesis. El GF es capaz de inhibir parcialmente la sinergia entre el TGFβ1 y la PGF2α, mientras que inhibe totalmente la sinergia entre el TGFβ1 y el OAG, en células sin pretratar. Es decir que la PKC no es suficiente, pero sí necesaria en la primer sinergia, y sí muy importante en la última. El agregado de GF por períodos prolongados, no logra retro-modular la PKC. Los receptores del TGFβ1, detectados con el uso de anticuerpos, están presentes en ambas condiciones, y la medición del transporte de glucosa, inducido por este factor, pone en evidencia que la actividad de los mismos, no se ve alterada por el pretratamiento con TPA. El agregado de ácido okadaico (5 nM), junto al TGFβ1, en células sin pretratar, induce la síntesis de ADN (lO % de células en fase S), indicando la presencia de fosfatasas de ser/thr, pero no sería el único impedimento, por el cual el TGFβ1 no es mitogénico en las células Swiss 3T3. En el estudio de las sinergias del TGFβ1 con insulina y PGE1, se observó que, en células pretratadas con TPA, PGE1 no induce la proliferación, ni potencia la inducción de esta última por el TGFβ1 solo o agregado con insulina. De estos resultados se concluye, que la PKC es necesaria para que la PGE1 potencie la sinergia entre el TGFβ1 más insulina. La falta de potenciación entre el TGFβ1 y la PGE1, podría indicar un camino de señalización en común. Inhibiendo la PKA con PKI, péptido inhibidor (l nM), y también con el uso del inhibidor H-89 (l nM), se encontró que la inhibición de esta enzima no altera la inducción de la proliferación por el TGFβ1, en células pretratadas con TPA. Con el uso del inhibidor genisteina (10 μM), se observó que las quinasas de tirosina están involucradas en la sinergia del TGFβ1 y la PGF2α, en ambas condiciones, y en la inducción de la proliferación por el TGFβ1, en células pretratadas con TPA. El uso de lovastatina (80 μM) y mevalonato (800 μM), puso en evidencia la importancia relativa de la isoprenilación de proteínas, en la sinergia entre el TGFβ1 y la PGF2α, en ambas condiciones. El TGFβ1 no activa la MAPK (ERK 1/2) en ninguna condición, ni potencia la actividad, ni la presencia de la misma, en la sinergia con la PGF2α. La actividad de esta enzima se midió, a través de la inmunoprecipitación y fosforilación de la mielina básica, y con el anticuerpo anti ERK 1/2, bifosforilado (forma activa). El TGFβ1 induce la translocación de la Smad4 (medida por inmunoflourescencia, con anticuerpo anti Smad4), en ambas condiciones, y ésta no se ve alterada en las sinergias de este factor y la PGF2α. En conclusión, el TGFβ1 induce la proliferación celular en células Swiss 3T3, que han sido pretratadas con compuestos capaces de retro-modular la PKC, es decir, primero activada y luego degradada. La inducción de la ciclina Dl, debe ocurrir por una vía alternativa a ERK l y 2. El pretratamiento con TPA lleva a las células a una fase G0 diferente de la misma fase en la que se encuentran las células confluentes y aquietadas, sin pretratar. El TGFβ1 activa las moléculas señalizantes específicas de su camino de señalización, y éstas deben interaccionar con factores de transcripción u otros compuestos, que surgen por el pretratamiento con TPA, haciendo que la fase G1 sea más larga, tiempo en el cual se sintetizan y/o modifican compuestos necesarios para inducir la proliferación celular.

Abstract:
TGFβ is a superfamily of polypeptides that can differencially regulate mammalian cell division. Depending upon TGFβ1 interaction with various cell types, its action can cause inhibition, promotion, as well as potentiation of cell division. In confluent resting Swiss 3T3 cells, TGFβ1 (0,5-2 ng/ml) neither not induce, nor inhibits cellular proliferation. However, this factor enhances PGF2α (300 ng/ml) proliferative response, in this cell type . Of PGF2α-induced signalling activities, our endeavour was focused in to those involved in the synergy with TGFβ1. The first activity studied was protein kinase C (PKC), through it's “down-modulation” either with the phorbol ester, 12-tetradecanoylphorbol l3-acetate (TPA, 800 nM, 96 hs), or Bryostatin 1 (100 nM, 96 hs). In PKC “down-modulated” cells, TGFβ1 can induce entry in S phase (50 % of cells in S phase, after 28 hs of stimulation, and 50 % more cells, upon 48 hs of stimulation), being dependent upon factor concentration, as well as on PKC-“down-modulating” compounds concentration. In TPA-treated cells, the G1 phase is of 6 to 7 hs more, than cells without treatment. In the first condition, TGFβ1 induced cyclin D1 expression, and in correlation with the G1 phase extension time, this expression occurs hours latter after stimulation (10-12 hs), compared with cells without treatment, stimulated with PGF2α (6-9 hs) . It was interesting to observe that PGF2α induced cyclin D1 expression in TPA-treated cells, eventhough in this condition failed to induce mitogenesis, and even with CDK4 presence. This results implie that cyclin D1 expression, does not necessarily indicate that cells are going to divide, and that such event is independent of PKC activity. Using monoclonal antibody anti PKCα , we reveal that this enzyme is absent upon TGFβ1 addition, in TPA-treated cells. PKC direct inhibition with GF 109203X (10 μM), PKC-specific inhibitor, added 1 hour prior to cells without treatment, was not enough to allow TGFβ1 induce mitogenesis. GF inhibited parcially the synergy between TGFβ1 and PGF2α, and prevent totally the action between TGFβ1 and OAG, in cells without treatment. Thus, PKC is not sufficient, but yet necessary in the first synergy, and important in the last one. GF added for long periods of time, is not capable of down-modulates PKC. TGFβ1 receptors, detected by antibodies, are present in both conditions, and glucose transport measurements, induced by this factor, puts in evidence, that receptor activities are not altered by TPA treatment. Okadaic acid (5 nM) added with TGFβ1, in cells without treatment, induce DNA synthesis (10 % of cells in S phase), indicating the existence of ser/thr phosphatases. However, this would not be the only retrain for TGFβ1 to induce mitogenesis in Swiss 3T3 cells. In the synergies study between TGFβ1, insulin and PGE1, it was observed that in TPA-treated cells, PGE1 neither induce proliferation, nor enhances TGFβ1 action, added without or with insulin. From this findings we conclude that PKC is necessary for PGE1 to enhance the synergy between TGFβ1 and insulin. The lack of synergy between PGE1 and TGFβ1, may indicate that they share common signalling pathways. PKA inhibited using PKI (1 nM), peptide inhibitor, and H-89 (1 nM) inhibitor, reveal that this activity is not involved in TGFβ1-induced proliferation, in TPA-treated cells. The use of inhibitor Genistein (10 μM), enable to show that tirosine kinases activities might be involved in the synergy between TGFβ1 and PGF2α, in both conditions, as well as for the TGFβ1-induced proliferation in TPA-treated cells. Using lovastatin (80 μM) and mevalonate (800 μM), indicated the relative importance of protein isoprenylation in the synergy between TGFβ1 and PGF2α, under both conditions. TGFβ1 did not activate MAPK (ERKl/2) in any condition, nor enhanced it's activity or presence in the synergy between PGF2α. MAPK activity measured by immunoprecipitation and phosphorylation of myelin basic protein, as well as by immunodetection with antibody anti ERK 1/2 biphosphorylated (active form). Thus, this results indicated that MAPK activity was induced only by PGF2α, and was not altered by TGFβ1 addition. Smad4 translocation induced specifically by TGFβ1 (measured by immunofluorescence with antibody anti Smad4), in both conditions, is not altered in the synergy with PGF2α. We conclude that TGFβ1 induces proliferation in Swiss 3T3 cells, whose PKC had been “down-modulated” by specific compounds, thus, first activated and then degraded. Cyclin D1 induction by TGFβ1 may occurs via an alternative mechanisms to ERK 1/2 action. TPA treatment leave the cells in a different G0 state, compared with the same state in which confluent and resting Swiss 3T3 cells are. TGFβ1 activated its specific signalling molecules, and this ones may interact with transncription factors or other compounds, which appeared by TPA treatment, thus lengthening G1 phase duration, required for the synthetisis and/or modification of compounds necessaries to induce cellular multiplication.

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Registro:
Título : Mecanismos de señalización inducidos por el factor de crecimiento y transformación Beta 1 (TGF beta sub 1), en fibroblastos de ratón Swiss 3T3     =    Signalling mechanisms induced by transforming growth factor beta 1 (TGF Beta sub1), in Swiss 3T3 fibroblasts
Autor : Cadenas, María Belén
Director : Jiménez de Asúa, Luis
Director Asistente : Ielpi, Luis
Año : 2000
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Fundación Campomar. Instituto de Investigaciones Bioquímicas
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3296_Cadenas
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Biología Molecular y Celular
Palabras claves : TGF BETA1; PKC; TPA; CICLO CELULAR; MECANISMOS DE SEÑALIZACION; PGF2ALFA; SWISS 3T3; TGFBETA1; PKC; TPA; CELL CYCLE; SIGNALLING MECHANISMS; PGF2ALFA; SWISS 3T
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