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Ver el documento (formato PDF)   Levi, Valeria.  "La estabilidad térmica de la bomba de calcio de membrana plasmática"  (2001)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
El estudio estructural y funcional de las proteínas de membrana se ve dificultado por la gran complejidad de los sistemas en las cuales éstas se hallan insertas, y porque, en general, estas proteínas se inactivan espontáneamente. La estructura tridimensional de una proteína está determinada por la interacción entre los grupos que componen la cadena polipeptídica, y entre estos grupos y el medio en el cual se halla inserta. Estas fuerzas intra e intermoleculares también definen su estabilidad. Además, para que una proteína cumpla su función biológica, se requiere que conserve su estructura nativa. Estas observaciones muestran una estrecha relación entre la estructura, la estabilidad y la función de las proteínas, y sugieren que se pueden evaluar características estructurales y funcionales de las mismas a partir del estudio de su estabilidad. Este enfoque fue empleado en el estudio de la bomba de calcio de membrana plasmática (PMCA), una proteína integral de membrana, de Mr 134000, responsable del transporte de Ca2+ hacia el exterior de células eucariotas. La energía requerida para esta función proviene directamente de la hidrólisis del ATP. En una primera etapa, determinamos que la pérdida espontánea de la actividad Ca2+-ATPasa de la bomba de calcio purificada y reconstituida en micelas de fosfolípidos y detergente, sería consecuencia de la desnaturalización de la proteína. La inactivación siguió una cinética de pseudo-primer orden, que estaria asociada a una transición entre dos estados y ocurriría a través de un único mecanismo en el intervalo 33-45 °C. Dado que el proceso es irreversible, el coeficiente cinético de la inactivación es inversamente proporcional a la estabilidad de la enzima. Una vez caracterizado este proceso, estudiamos los cambios en la disposición estructural de la enzima durante la desnaturalización térmica. Para ello empleamos un análisis combinado que incluyó el análisis de la fluorescencia de un conjunto de sondas específicas y ensayos de actividad enzimática. Establecimos que el dominio de unión a calmodulina se desnaturaliza antes que el dominio catalítico, en tanto que el dominio transmembránico permanece plegado durante la desnaturalización térmica. Como la función vinculada a los distintos dominios es afectada por ligandos específicos de la enzima, exploramos el efecto de éstos en la estabilidad. Determinamos que Ca2+, calmodulina y un análogo no hidrolizable del ATP estabilizan al dominio catalítico. Exploramos además el efecto de un ligando cuya relevancia sobre la estructura y función de la bomba no ha sido determinada, i.e., la propia bomba de calcio. La dimerización fue caracterizada empleando la transferencia de energía entre la bomba de calcio marcada con la sonda fluorescente FITC y la marcada con EITC. El mecanismo molecular de la dimerización fue estudiado determinando la eficiencia de la transferencia de energía entre FITC-PMCA y EITC-PMCA luego de desplegar distintas regiones de la enzima. Estos ensayos permitieron definir que la dimerización involucra la interacción entre el dominio de unión a calmodulina y dos segmentos de la bomba a las cuales se une el péptido C28W cuya secuencia se encuentra incluida en la del mencionado dominio. La relevancia biológica del proceso de dimerización fue estudiada determinando la dependencia de la estabilidad de la bomba de calcio con su concentración. El análisis teórico de los resultados obtenidos permitió determinar que la estabilidad de la bomba de calcio dimérica es 200 veces mayor que la monomérica. La estructura y función de las proteínas de membrana se encuentran íntimamente relacionadas con los sistemas micelares en el cual se hallan insertas. Por este motivo, exploramos la dependencia de la estabilidad de la bomba purificada con la composición de las micelas. Basándose en los resultados obtenidos en tres sistemas micelares diferentes, postulamos un modelo que propone que la estabilidad de la enzima aumenta a medida que la monocapa de anfifilos que recubre la superficie hidrofóbica del dominio transmembránico se enriquece en fosfolípidos. La composición de la monocapa está relacionada con la afinidad de los fosfolípidos respecto a la del detergente por esta superficie (KLD). Desarrollamos un método que permite determinar KLD utilizando transferencia de energía entre los residuos triptofano de la PMCA y un fosfolípido marcado con pireno. Los valores de KLD obtenidos por este procedimiento son consistentes con los determinados a partir del modelo. En conclusión, los resultados obtenidos en este trabajo de tesis sugieren que el estudio de la estabilidad de proteínas podría constituir una metodología general de gran utilidad para explorar aspectos estructurales y funcionales de una amplia gama de proteínas.

Abstract:
Structural and functional studies on membrane proteins are limited by the complexity of the micellar system in which these proteins are inserted. In addition, these proteins undergo spontaneous inactivation. Protein structure is determined by intra and intermolecular forces that also define its stability. Moreover, the proteins are biologically functional only if they preserve their native structure. These observations show the close relation among structure, stability and function, and suggest that structural and functional characteristics of a protein could be evaluated from stability studies. This approach was applied to an integral membrane protein, i.e., the plasma membrane calcium pump (PMCA) reconstituted in mixed micelles of phospholipids and detergent. This protein of Mr 134000 is responsible for the active Ca2+ transport through the membrane to the external milieu in the eukaryotic cells. Initially, we characterized the spontaneous lost of the Ca2+ ATPase activity, and determined that this process is a consequence of the enzyme denaturation. The inactivation followed a first-order kinetics that could be associated with a transition between the native and the denatured states with a common mechanism in the range 33-45 °C. Since this process was irreversible, the kinetic coefficient of the enzyme inactivation provides a measure of the enzyme stability. The structural domain organization of the enzyme was studied by using a combined spectroscopic and kinetic approach that allows the parallel evaluation of the structural and functional changes occurring at specific regions of the protein. We established that the calmodulin-binding domain unfolds earlier than the catalytic domain while the transmembrane domain remains folded during thermal inactivation. Since specific ligands of the pump affect the enzyme function, we explored their effects on protein stability. We determined that Ca2+, calmodulin and a nonhydrolyzable analog of ATP increased the enzyme stability. In addition, we studied the effects of the plasma membrane calcium pump self-association on the structural stability of the enzyme. Energy transfer measurements between the enzyme labeled with the fluorescent probes FITC and EITC were employed to evaluate the dimer and monomer distributions as a function of the total enzyme concentration. The enzyme thermal stability was assayed at different dimer/monomer ratios and analyzed in terms of a model that considers the equilibria among dimers, monomers and mixed dimers formed by a thermal-inactivated and an active monomers. Each of these species is inactivated following an irreversible step. The dimer stability was 200 fold higher that the stability of the monomeric enzyme indicating that thermal inactivation of the calcium pump proceeds mainly through the monomeric pathway. To explore the molecular mechanism of dimerization, energy transfer efficiency was determined after the unfolding of different enzyme domains by using different thermal treatments. We demonstrated the existence of two regions involved in the self-association process: the calmodulin-binding domain and the C28W-binding regions. The structure and the function of membrane proteins are intimately related to the micellar systems in which they are inserted. Therefore, we studied the calcium pump thermal stability in three micellar systems. The obtained results were explained in terms of a model that considers that thermal stability of the pump depends on the composition of the amphiphile monolayer directly in contact with the transmembrane protein surface. Application of this model shows that the maximal pump stability is attained when 80% of this surface is covered by phospholipids. This analysis also provides an indirect measure of the relative affinity phospholipid/detergent for the hydrophobic transmembrane surface of the protein (KLD) showing that those phospholipids with higher affinity provide greater stability to the Ca2+ pump. KLD values obtained by this procedure agreed with those obtained by measuring fluorescence resonance energy transfer from the protein tryptophan residues to a pyrene-labeled phospholipid. In summary, the results shown in this thesis, suggest that the study of protein stability could constitute a general methodology to explore structural and functional properties of membrane proteins.

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Registro:
Título : La estabilidad térmica de la bomba de calcio de membrana plasmática     =    Thermal stability of the plasma membrane calcicum pump
Autor : Levi, Valeria
Director : Rossi, Juan Pablo F.C.
Director Asistente : Gónzalez Flecha, Luis
Año : 2001
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Química Biológica
Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Química Biológica. Instituto de Química y Fisicoquímica Biológicas (IQUIFIB)
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Químicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3348_Levi
Idioma : Español
Area Temática : Química / Química Biológica
Palabras claves : PROTEINA DE MEMBRANA; ESTABILIDAD ESTRUCTURAL; BOMBA DE CALCIO; ATPASA; DESNATURALIZACION TERMICA; MEMBRANE PROTEIN; STRUCTURAL STABILITY; CALCIUM PUMP; ATPase; THERMAL DENATURATION
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