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Ver el documento (formato PDF)   Pozzi, Andrea Gabriela.  "Regulación de la actividad de la 3 beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa/isomerasa en el testículo de Bufo arenarum : Relación con la espermiación inducida por hCG"  (2001)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
La presente tesis describe los estudios realizados sobre la actividad de la enzima 3β-hidroxiesteroide deshidrogenasa/isomerasa (3βHSD/I), así como su participación en la regulación de la espermiación inducida por hCG en testículos de Bufo arenarum. La enzima 3βHSD/I se localiza en las fracciones mitocondrial y microsomal. Ambas localizaciones muestran diferente especificidad de sustrato, dehidroepiandrosterona (DHE) es el sustrato preferido de la enzima microsomal en tanto que la mitocondrial utiliza solamente pregnenolona. Esta doble localización establecería una compartimentalización de las dos vías de síntesis de esteroides previamente descriptas en B. arenarum: la via Δ4 en las mitocondrias y la via Δ5 en los microsomas. La actividad de ambas fracciones subcelulares es mayor en el período reproductivo que en el no reproductivo. Cuando se incluye DHE en el análisis cinético de la transformación de pregnenolona, se observa una importante modificación de la Vmax, en tanto que el Km permanece constante. Estos resultados indican que DHE se comporta como un inhibidor no competitivo de la conversión de pregnenolona. Los valores de Km y Ki sugieren la presencia de dos sitios de unión. Por otra parte, cuando se utiliza pregnenolona como inhibidor de la transformación de DHE, solo se modifica ligeramente el valor de Km, en tanto que la Vmáx se mantiene constante. Esto indica que pregnenolona se comporta como un inhibidor competitivo. Los valores del coeficiente de Hill para la transformación de DHE y pregnenolona son, respectivamente, 1.04 and 1.01. Estos estudios sugieren que en esta especie la biosíntesis de andrógenos y progesterona es catalizada por sitios activos diferentes. En esta tesis también se ha utilizado un sistema de espermiación in vitro, con el objeto de identificar, en el sapo, los posibles mediadores esteroideos de la espermiación. La espemiación fue inducida con hCG, utilizándose además distintos inhibidores de la esteroidogénesis. Cianocetona, inhibidor de la síntesis de 3-oxo-4-ene esteroides, no afectó la espermiación inducida por hCG aún cuando la síntesis de aquellos esteroides y sus derivados reducidos disminuyó en más de un 95%. Aminoglutetimida, usada en una concentración que bloqueó la síntesis de esteroides, tampoco afectó la espermiación estimulada por la gonadotrofina. Resultados similares se obtuvieron con spironolactona, inhibidor de la enzima 17α-hidroxilasa/17-20 liasa. Como conclusión, puede decirse que en B. arenarum, la espermiación inducida por hCG no está mediada por la síntesis de esteroides. Cuando el ensayo de espermiación se realizó utilizando FSH Humana recombinante (FSHrh), se observó tanto inducción de la espermiación como aumento en la síntesis de esteroides. La capacidad esteroidogénica de las células de Leydig ha sido establecida desde hace tiempo, sin embargo, la potencialidad esteroidogénica de las células de Sertoli es aún controversial. En este trabajo se informa, también, la separación de dos poblaciones celulares que responden diferencialmente a las gonadotrofinas humanas. Las fracciones con una densidad de 1.05 g/ml respondieron a hCG con un aumento en la producción de testosterona (T). Sin embargo no respondieron a FSHrh con un aumento de andrógenos ni de cAMP. La formación de cAMP fue estimulada en las fracciones con una densidad de 1.038 g/ml. Estas también respondieron a FSHrh con un aumento en la síntesis de T. Cuando FSHrh se ensayó sobre fragmentos de testículo, se observó también un aumento dosis-dependiente de la secreción de T. El método utilizado permitió la separación de dos poblaciones de células con características similares a las células de Leydig y Sertoli de cerdo y trucha. Sin embargo, la fracción con una densidad semejante a las células de Sertoli, respondió a FSHrh no solo con un aumento en la formación de cAMP, sino también con un incremento en T. Se podría concluir que el testículo de B. arenarum tendría células de Sertoli con capacidad esteroidogénica, como fuera descripto para otras especies, y que la espermiación podría ser inducida por las gonadotrofinas directamente sobre las células de Sertoli.

Abstract:
This thesis describes studies on the activity of the enzyme 3β-hydroxysteroid dehydrogenase/isomerase (3βHSD/I), as well as its participation in the regulation of hCG-induced spermiation in the testes of Bufo arenarum. 3βHSD/I localises in mitochondria and microsomes. Both locations have different substrate-specificity: microsomal enzyme prefers dehydroepiandrosterone (DHE) while mitochondria1 enzyme converts only pregnenolone. As a consequence of this dual localisation, a compartmentalisation of theΔ4 and Δ5 pathway previously described in 5. arenarum, can be proposed: the Δ4 pathway in mitochondria and the Δ5 pathway in microsomes. The activity of both fractions is higher during the reproductive season than during the nonreproductive period. The inclusion of DHE in the kinetic analysis of pregnenolone conversion affected Vmax while Km was not modified, suggesting a non-competitive inhibition of the conversion of pregnenolone. The Km and Ki values suggest the presence of two different binding sites. However, when pregnenolone was added in the assays with DHEA as substrate, no effect was observed on the Vmax while Km values slightly increased with pregnenolone concentration. Consequently, pregnenolone inhibited the transformation of DHEA in a competitive fashion. The Hill coefficient for the conversion of DHE and pregnenolone are 1.04 and 1.01, respectively. These studies suggest that, in this species, the microsomal biosyntheses of androgens and progesterone are catalysed by different active sites. This thesis also employs an in vitro system to identify potential steroidal mediators of spermiation in the toad. Spermiation was induced by hCG and the effect of different inhibitors of steroid-biosynthesis was analysed. Cyanoketone, an inhibitor of 3-oxo-4-ene steroid biosynthesis, do not block hCG-inducing activity even though biosynthesis of 3-oxo-4-ene is inhibited by 95%. Aminogluthetimide, at a concentration that inhibited testosterone (T) biosynthesis, do not alter hCG actions. Similar results were obtained with spironolactone, an inhibitor of 17α-hydroxylase/17-20 lyase activity. It is possible to conclude that in B. arenarum, hCC-induced spermiation is not mediated by steroid biosynthesis. The inclusion of Human recombinant FSH (rhFSH) in the spermiation-assay not only induces spermiation but also an increase of testosterone biosynthesis. The steroidogenic capability of Leydig cell has been largely established, however, the steroidogenic potentially of Sertoli cell is still controversial. in this work it is also reported the separation of two population cells with different responsiveness to human gonadotropins. T production was stimulated by hCG in fraction with a density of 1.05 g/ml. However, this fraction did not respond to rhFSH either with an increase in cAMP production or with T synthesis. rhFSH induced cAMP production in fraction corresponding to 1.038 g/ml. This fraction also responded to rhFSH with an increase in T production. The effect of rhFSH on testosterone production by testis fragment was also assayed. The gonadotropin evoked a dose-dependent increase in T secretion. The method employed in the present work has permitted the separation of two population cells resembling pig and trout Leydig and Sertoli cells. However, the fraction with a density similar to Sertoli cells responded to rhFSH not only with an increase in cAMP production but also with an important augment in androgen synthesis. We can conclude that the testes of B. arenarum have Sertoli cells with steroidogenic capability and that spermiation could be elicited by the action of gonadotropins on Sertoli cells.

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Registro:
Título : Regulación de la actividad de la 3 beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa/isomerasa en el testículo de Bufo arenarum : Relación con la espermiación inducida por hCG     =    Regulation of 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase-isomerase activity in testis of Bufo arenarum. Relationship with hCG-induced spermiation
Autor : Pozzi, Andrea Gabriela
Director : Ceballos, Nora Raquel
Jurados : Tessone , M.  ; Barañao, J.   ; Cozza, E.
Año : 2001
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Endocrinología Comparada
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3353_Pozzi
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Fisiología Animal
Biología / Endocrinología
Palabras claves : 3BETA-HIDROXIESTEROIDE-DESHIDROGENASA/ISOMERASA; TESTICULO; ANFIBIO; GONADOTROFINAS; ESPERMIACION; 3BETA-HYDROXYSTEROID DEHIDROGENASE/ISOMERASE; TESTIS; AMPHIBIAN; GONADOTROPINS; SPERMIATION
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