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Ver el documento (formato PDF)   Ellerman, Diego A..  "Relación estructura-función de la proteína epididimaria de rata "DE", y su potencial uso para el desarrollo de un método de regulación de la fertilidad"  (2001)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
La glicoproteína epididimaria de rata "DE" se asocia al espermatozoide durante la maduración, y participa en el proceso de fusión de gametas a través de sitios complementarios presentes en la superficie del ovocito. Con el fin de comprender los mecanismos involucrados en la participación de DE en dicho proceso, se estudió la importancia de la estructura de DE para la actividad de la proteína. El clonado del ADNc de DE permitió obtener la secuencia de los 227 aminoácidos (aa) de la proteína. El análisis de dicha secuencia indicó que DE pertenece a la familia CRISP (cystein rich secretory proteins), y la presencia de 16 cisteínas en la molécula. El ADNc fue utilizado luego para expresar la proteína recombinante en bacterias (recDE). El estudio de recDE y de la proteína nativa deglicosilada, indicó que la actividad biológica residiría en la porción peptídica de la molécula. Por otro lado, el análisis del estado de oxidación de las cisteínas indicó que la mayoría de ellas formaría puentes disulfuro, y que la ruptura de los mismos afectaría la actividad de la proteína. La expresión de distintos fragmentos recombinantes de DE y su empleo en ensayos biológicos, reveló que la actividad de la proteína residiria en la región comprendida entre los aa 62-158. Resultados previos de nuestro laboratorio indican que la inmunización de ratas con proteína DE produce una respuesta inmune y una inhibición significativa de la fertilidad. El presente trabajo indica que los mecanismos responsables de dicha inhibición involucrarían la entrada de anticuerpos anti-DE al tracto reproductivo, su interacción con los espermatozoides, y la disminución de la capacidad fertilizante de los mismos, abriendo la posibilidad del potencial uso de DE para el desarrollo de un método inmunológico de regulación de la fertilidad. Dado que para ello es necesario poder disponer del antígeno en grandes cantidades, la proteína recombinante fue utilizada en ensayos de inmunización, que indicaron que recDE, al igual que la proteína nativa, es capaz de producir una respuesta inmune y una reducción de la fertilidad. Con el fin de investigar la posible aplicación de este método inmunológico en el hombre, la capacidad inmunogénica de la proteína humana homóloga a DE, proteína ARP, fue estudiada en un modelo de primates no humanos, observándose la inducción de una elevada respuesta inmune en los animales inmunizados. En conjunto, los resultados obtenidos en este trabajo contribuyen al esclarecimiento de los mecanismos involucrados en la participación de DE en el proceso de fusión de gametas, y apoyan el potencial uso de esta proteína y sus homólogos para el desarrollo de un método inmunológicode regulación de la fertilidad tanto en animales como en el hombre.

Abstract:
Rat epididymal glycoprotein “DE” associates with sperm during maturation and participates in gamete fusion through complementary sites localized on the egg surface. To get a better understanding of the molecular mechanisms underlying the participation of DE in this process, the relevance of protein DE structure for its biological activity was studied. Cloning of DE cDNA allowed obtaining the sequence of the 227 aminoacids (aa) of the protein. The analysis of the sequence, indicated that DE belongs to the CRISP (cystein rich secretory proteins) family, and the presence of 16 cysteines in the molecule. DE cDNA was then used for the bacterial expression of the recombinant protein (recDE). The study of recDE as well as of the deglycosilated native DE (nDE) indicated that the activity of the protein resides on the peptidic portion of the molecule. The evaluation of the oxidative state of cysteines indicated that most of them would be involved in disulfide bridges, and that the rupture of these bridges would affect the protein activity. The expression of different recombinant fragments of DE, and their use in biological assays indicated that the biological activity of DE would be located within the region encompassed by aa 62-158. Previous results from our laboratory indicate that immunization of rats with protein DE induces an immune response and a significant inhibition of fertility. The present study indicated that the mechanisms responsible for this inhibition would involve the entry of antibodies into the reproductive tract, their association to sperm, and the reduction of sperm fertilizing ability. These results suggested the potential use of DE for developing and immunological method of fertility regulation. Since an important requirement for this purpose, is the possibility of obtaining the antigen in large quantities, recombinant DE was used in immunization studies, which revealed that, like native DE, recDE is able to produce an immune response as well as an inhibition of fertility. In order to explore the potential application of this immunological approach to humans, the immunogenic ability of the human protein homologue of DE, protein ARP, was evaluated in a non human primate model. The induction of a high immune response was observed in all the immunized animals. Together, the results obtained in this work contribute to a better understanding of the molecular mechanisms underlying the participation of DE in sperm-egg fusion, and support the potential use of DE for the development of an immunological method of both animal and human fertility regulation.

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Registro:
Título : Relación estructura-función de la proteína epididimaria de rata "DE", y su potencial uso para el desarrollo de un método de regulación de la fertilidad     =    Structure-function relationship of rat epididymial protein DE and its potential use for the development of an immunological method of fertility regulation
Autor : Ellerman, Diego A.
Director : Cuasnicú, Patricia S.
Año : 2001
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Instituto de Biología y Medicina Experimental (IByME)
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3358_Ellerman
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Reproducción
Biología / Inmunología
Biología / Biología Molecular y Celular
Palabras claves : REPRODUCCION; FERTILIZACION; ESPERMATOZOIDE; OVOCITO; FUSION DE MEMBRANAS; FERTILIDAD; ANTICONCEPCION; ANTICUERPOS ANTI-ESPERMATOZOIDE; REPRODUCTION; FERTILIZATION; SPERM; OOCYTE; MEMBRANE FUSION; CONTRACEPTION; ANTI-SPERM ANTIBODES
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