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Ver el documento (formato PDF)   D’Alessio, Cecilia.  "Rol de los oligosacáridos monoglucosilados en el plegamiento de glicoproteínas en Schizosacchatomyces pombe"  (2001)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
El retículo endoplasmático (RE) es el compartimiento de varias modificación post-traduccionales y plegamiento de proteínas destinadas a secreción, a membrana plasmática o a organelas del sistema endocítico. Una de las modificaciones post-traduccionales mas frecuentes, la N-glicosilación, está relacionada con el plegamiento de las proteínas ya que sin la adición de N-glicanos, numerosas especies proteicas son incapaces de alcanzar su conformación nativa. Los intermediarios de plegamiento, las proteínas oligoméricas no totalmente ensambladas, las proteínas mal plegadas y los agregados son selectivamente retenidos en el RE. El transporte hacia el aparato de Golgi ocurre solamente cuando las proteínas se han plegado y ensamblado correctamente. El mecanismo que asegura la funcional de las proteínas que salen del RE, ha sido denominado “control de calidad del plegamiento de glicoproteínas". En la mayoría de los eucariotas la N-glicosilación comienza con la transferencia de un oligosacárido de composición Glc3Man9GlcNAc2 desde un intermediario lipídico (dolicol difosfato) a la secuencia Asn-X-Ser/Thr de proteínas nacientes en el RE. Las tres glucosas terminales del oligosacárido transferido son inmediatamente removidas pordos glucosidasas del RE, I y II (GI y GII). Parodi y colaboradores demostraron la existencia de una reglucosilación transitoria de los N-oligosacáridos libres de glucosa dentro del RE por la acción de la enzima luminal UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (GT). Esta enzima glucosila glicoproteínas, en ensayos libres de células, sólo si éstas han sido previamente desnaturalizadas. Por esta característica especial se ha propuesto a la GT como posible sensor del estado conformacional de las glicoproteínas en el RE. Los oligosacáridos monoglucosilados, que se generan por la deglucosilación parcial por la GI (encargada de remover la glucosa más externa) y GII (encargada de remover las dos glucosas más internas) y por la actividad de la GT, permiten la interacción de las glicoproteínas con dos lectinas del RE, la calreticulina (CRT) y/o calnexina (CNX). Esta interacción facilita el plegamiento de las glicoproteínas, evita la formación de agregados, permite la interacción de las glicoproteínas unidas a CNX con otras chaperonas del RE y constituye un mecanismo para retener en el RE las estructuras proteicas mal plegadas. En la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe existen todos los componentes del modelo de control de calidad de glicoproteínas en el RE, ya que esta levadura expresa actividad GT y posee un homólogo de CNX. Además, el oligosacárido transferido a polipéptidos nacientes es Glc3Man9GlcNAc2 y este compuesto es procesado en el RE a Man9GlcNAc2, indicando la presencia de actividades GI y GII. La disrupción del gen que codifica la CNX en S. pombe ha resultado ser letal para estas células. Sin embargo una mutante deficiente en actividad GT (mutante gpt1) obtenida en nuestro laboratorio no posee ningún fenotipo distintivo. Esto planteó el interrogante de cuál es la importancia y el rol de la formación de oligosacáridos monoglucosilados en el plegamiento de glicoproteínas en estas levaduras. En este trabajo se realizaron además experimentos destinados a analizar si una conformación mal plegada es condición suficiente para para la glucosilación de todos los olgosacáridos N-unidos a proteínas por la GT in vivo, tal como ocurre in vitro. En este trabajo de Tesis se presentan evidencias genéticas de la estructura heterodimérica propuesta para la GII. La GII de S. pombe está compuesta de dos subunidades GIIα y GIIβ. La actividad catalítica está presente en la subunidad GIIα, que carece de señal conocida para permanecer en el RE. La subunidad GIIβ posee en el extremo C-temiinal el tetrapéptido VDEL, homólogo a conocidas señales de retención/recuperación en el lumen del RE. En S. pombe la CNX es esencial para la viabilidad celular. Sin embargo, la disrupción del gen que codifica para GIIα abolió totalmente la formación de oligosacáridos monoglucosilados, tanto por deglucosilación del compuesto transferido a las proteinas como por reglucosilación mediada por la GT. Estas mutantes de S. pombe resultaron viables a todas las temperaturas ensayadas. Esto significa que la CNX y no los oligosacáridos monoglucosilados son esenciales para esta levadura en condiciones normales de crecimiento. Si bien la formación de oligosacáridos monoglucosilados no es esencial para la viabilidad celular, células defectivas total (mutantes GIIα-) o parcialmente (mutantes GIIβ- o GT-) en la formación de oligosacáridos monoglucosilados presentaron una acumulación de proteínas mal plegadas en el RE en ausencia de estrés adicional. Esto se evidenció por la inducción de mensajeros que codifican para chaperonas del RE (respuesta a proteínas mal plegadas o UPR). La acumulación de proteínas mal plegadas en estas mutantes se evidenció además por la presencia en sus glicoproteínas de una mayor proporción de oligosacáridos con estructuras específicas del RE y no del aparato de Golgi. Los glicanos sintetizados por estas mutantes son similares a los obtenidos cuando se agregó a células salvajes un agente reductor que provoca un mal plegamiento en las glicoproteínas que se están sintetizando en el RE. Tal como fue descripto para células de mamifero, en células intactas de S. pombe la formación de oligosacáridos monoglucosilados reduce la velocidad de plegamiento, pero incrementa su eficiencia. Esto fue evidenciado por una comparación de la cantidad de carboxipeptidasa y la velocidad de llegada a la vacuola de esta proteína en células salvajes y GIIα-. Este resultado indicó que los oligosacáridos monoglucosilados están involucrados en la facilitación del plegamiento de las glicoproteínas de S. pombe. La formación de proteínas mal plegadas causada tanto por el agregado de una agente que impide la formación de puentes disulfuro (ditiotreitol) a células intactas, como por un shock de calor, no fueron condiciones suficientes para la glucosilación in vivo mediada por la GT. dichos tratamientos no resultaron en un aumento generalizado de la glucosilación. La explicación para este resultado podría estar en las restricciones de la GT para reconocer sus sustratos: aparentemente la GT sólo glucosilaría glicoproteínas que presentan una estructura parcial o un intermediario del plegamiento con flexibilidad limitada, ausente en las formas completamente desplegadas. Estos resultados sugieren que las glicoproteínas que se pliegan en el RE son sometidas al sistema de control de calidad del plegamiento en las etapas finales del proceso de plegamiento.

Abstract:
The endoplasmic reticulum (ER) is the intracellular location of some post-translational modifications and folding of proteins destined to secretion, to the plasma membrane or to organelles of the endocytic system. N-glycosylation is one of the most frequent modifications. This modification is related to protein folding, as many species are unable of properly fold without N-glycan addition. Folding intermediates, incomplete assembled oligomers, misfolded proteins and aggregates are selectively retained in the ER. Transport to Golgi compartments takes place only if proteins are in their native conformation and properly assembled. The mechanism that ensures the functionality of proteins that exit the ER, is the so called “quality control of glycoprotein folding”. In most eucariotic cells, N-glycosylation is initiated on transfer of an oligosaccharide (Glc3Man9GlcNAc2)from a lipid-carrier (dolichyl diphosphate), to the sequence Asn-X-Ser/Thr in nascent proteins in the ER. The three terminal glucose residues of the transferred oligosaccharide are irnmediately trimmed by two ER glucosidases, I and II (GI and GII). Parodi and coworkers demonstrated the occurrence of transient reglucosylation of glucose-free N-linked oligosaccharides in the ER by a lumenal enzyme, the UDP-Glc:glycoprotein glucosyltransferase (GT). This enzyme glucosylates glycoproteins in a cell-free assay, only if they have been previously denatured. For this especial feature, GT has been proposed as a possible sensor of glycoprotein conformation in the ER. Monoglucosylated oligosaccharides can be generated by partial deglucosylation by of GI (that removes the most terminal glucose) and GII (that trims both inner glucose residues), or by GT. Monoglucosylated oligosaccharides allow interaction of glycoproteins with two ER lectins, calnexin (CNX) and/or calreticulin (CRT). This interaction facilitates glycoprotein folding, avoids aggregation of glycoproteins, allows interaction of bound glycoproteins with the ER chaperone system and constitutes a retaining mechanism of misfolded glycoproteins in the ER. The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has the three elements of the quality control of glycoprotein folding in the ER as this yeast expresses a GT activity and a CNX homologue. In addition, the oligosaccharide transferred to nascent polypeptides is Glc3Man9GlcNAc2 and this compound is processed in the ER to Man9GlcNac2 indicating the presence of both GI and GII activities. The disruption of the gene encoding CNX in S. pombe has been shown to be lethal. However, a mutant lacking GT activity (gpt1) obtained in our laboratory had no discernible phenotype. This raised the question of the actual importance of monoglucosylated oligosaccharide formation in glycoprotein folding in this yeast and its role in glycoprotein folding. Further work reported here was performed in order to test whether a misfolded conformation is a sufficient condition for in vivo glucosylation of all N-linked oligosaccharides by GT as was observed in vitro. Results presented herein provide genetic support for a proposed heterodimeric structure of GII. S. pombe GII appears to be composed by two subunits GIIα and GIIβ. Catalytic activity is contained in GIIα subunit, which in turn lacks any known ER retrieval signal. GIIβ has in its C-terminal sequence the tetrapeptide VDEL, homologous to known lumenal ER retrieval signal. A model is proposed in which GII β-subunit functions as the retrieval element of GII α-subunit to the ER. CNX resulted essential for S. pombe viability. However, GIIα subunit disruption completely abolished the formation of monoglucosylated oligosaccharides, both by deglucosylation of the transferred compound as by GT-mediated reglucosylation. This mutant was viable at all temperatures tested. It was concluded that CNX but not monoglucosylated oligosaccharides is essential for this yeast. Although monoglucosylated oligosaccharide formation is not essential for cell viability, cells totally (GIIα minus) or partially (GIIβ or GT minus) defective in monoglucosylated oligosaccharide formation showed accumulation of misfolded proteins in the ER in the absence of any exogenous stress. This was evidenced by the induction of mRNAs encoding ER chaperones (unfolded protein response). Besides, misfolding of glycoproteins in those mutants was reveled by the much higher proportion of protein-linked oligosaccharides having ER-specific structures and lacking Golgi-specific modifications. Glycans synthesized by the mutants displayed sizes similar to those found when a reducing agent that prevents proper protein folding in the ER was added to wild type cells. As was described for mammalian cells, also in intact S. pombe cells formation of monoglucosylated oligosaccharide decreased the folding rate but increased the folding efficiency as judged by comparison of amounts and rates of arrival of carboxypeptidase Y to the vacuole in wild type and GIIα minus cells. This result indicated that monoglucosylated glycans are indeed involved in glycoprotein folding facilitation in the fission yeast. Protein misfolding caused both by addition of a reagent that prevents disulfide bond formation (dithiothreitol) to intact cells as well as by a heat shock treatment were not conditions sufficient for in vivo GT-mediated glucosylation. Those treatments did not result in a generalized glycoprotein glucosylation. The explanation for this result may lie in GT restrictions to recognize its substrates. Apparently GT only glucosylates partially structured conformers or folding interrnediates bearing a limited flexibility that is absent in less structured species. These results suggest that glycoproteins are mainly subjected to ER quality control in the last folding stages.

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Registro:
Título : Rol de los oligosacáridos monoglucosilados en el plegamiento de glicoproteínas en Schizosacchatomyces pombe     =    Role of monoglucosylated oligosaccharides in glycoprotein folding facilitation in Schzosaccharomyces pombe
Autor : D’Alessio, Cecilia
Director : Parodi, Armando J.
Año : 2001
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Fundación Campomar. Instituto de Investigaciones Bioquímicas
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Químicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3360_DAlessio
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Biología Molecular y Celular
Palabras claves : GLUCOSIDASA II; GLUCOSILTRANSFERASA; PLEGAMIENTO DE GLICOPROTEINAS; SCHIZOSACCHAROMYCES POMBE; GLUCOSIDASE II; GLUCOSYLTRANSFERASE; GLYCOPROTEIN FOLDING; SCHIZOSACCHAROMYCES POMBE
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