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Ver el documento (formato PDF)   Giambiagi, Susana.  "Estudios moleculares del gen 11 de rotavirus"  (2001)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
Los mecanismos de variación y evolución en los rotavirus comprenden no sólo las mutaciones puntuales introducidas por la RNA polimerasa durante la replicación y la reasociación de segmentos virales durante infecciones mixtas, sino también los reordenamientos que se producen dentro de cada segmento genómico. Estos reordenamientos no afectan la estructura conservada de los segmentos genómicos (extremos 5' y 3' conservados), y esta estructura se supone relacionada con la capacidad de replicación y empaquetamiento del genoma viral en nuevas partículas virales. Con el objetivo de estudiar los mecanismos de reordenamiento genómicos en rotavirus se analizó la estructura molecular del segmento genómico 11 reordenado de distintos rotavirus humanos de "electroferotipo corto", aislados de niños infectados. De acuerdo a los resultados obtenidos, el segmento 11 reordenado de los aislamientos virales analizados tiene una inserción de 148 nucleótidos en la región 3' no traducida del segmento viral. Las secuencias obtenidas de los segmentos 11 de los distintos aislamientos virales analizados fueron altamente homólogas entre sí y con las secuencias de los segmentos 11 de otras dos cepas de rotavirus humanos decriptas previamente: RVS y DS-1. La inserción no afecta la región codificante del gen 11, ni la secuencia y localización de la región 3' no codificante, común a todos los segmentos 11 de los rotavirus tipo A. La secuencia de la inserción, rica en A y T, no presenta homología con el segmento 11 normal ni con otros segmentos virales. Los resultados obtenidos permitieron identificar y estudiar un nuevo mecanismo de reordenamiento genómico en rotavirus, en el cual no hay una duplicación parcial del segmento genómico. Un segundo objetivo de la tesis consistió en el desarrollo de un sistema que permita obtener rotavirus recombinantes. Se estudiaron las secuencias requeridas para que un ARN sea reconocido por la maquinaria viral y sea replicado y empaquetado en nuevas partículas virales. Para estudiar las secuencias involucradas en el reconocimiento del ARN viral por la polimerasa viral hemos construído un plásmido recombinante que al ser transcripto produce un ARN que contiene las secuencias 5' y 3' no traducidas del segmento 11 viral, flaqueando la región codificante del gen CAT. Este ARN es amplificado cuando es transfectado en el citoplasma de células infectadas con rotavirus. De acuerdo a los resultados obtenidos, las señales involucradas en el reconocimiento del ARN por la polimerasa viral con actividad replicasa están localizadas en el extremo 3' no codificante. La polimerasa requiere para iniciar la síntesis de la cadena - del segmento 11, no sólo la secuencia consenso 3', común a todos los segmentos virales, sino también la formación de una estructura de horquilla dejando un extremo 3' libre de 18 nucleótidos que incluyen la secuencia consenso terminal. Aunque la metodología propuesta ha permitido desarrollar un método valioso para el análisis de las secuencias de RNA capaces de ser reconocidas por el complejo de replicación viral, la misma no resultó satisfactoria para la obtención de partículas virales recombinantes. Es posible que existan otras señales importantes para el empaquetamiento que probablemente se localicen en la región codificante del segmento 11, y por lo tanto que están ausentes en nuestra construcción.

Abstract:
The mechanisms of genome variation and evolution in rotavirus, involve not only the mutations introduced by RNA polymerase during replication and the reassociation of genomic segments during infection, but also the rearrangement of genomic segments. The rearrangements don't modify the conserved structure of the genomic segments (conserved 5' and 3' ends), and this structure is supposed to be related with the replication and packaging of the viral genome. The first objective of this thesis was to study the genomic rearrangement mechanism in rotavirus. We have studied the molecular structure of the rearranged genomic segment 11 of different virus isolated from infected children. According to the results, the rearranged segments 11 of the viral isolates have an insertion of 148 nt in the 3' untranslated region. The sequences in all 6 isolates were highly conserved among them, and with those of human strains DS-1 and RVS. The insertion does neither affect the gene 11 coding region nor the sequence and localization of the 3' non coding region, conserved in all the 11 segments of rotavirus group A. The sequence of the insertion, A + T rich, has no clear resemblance with the normal gene 11 sequence nor with other viral segments. The results obtained have allowed identifying and studying a new mechanism of genomic rearrangement in rotavirus, in which partial duplication of genomic segment is not involved. The second objective was to develop a system for obtaining recombinant rotaviruses. We have developed an assay to study the RNA cis-acting signals that promote the synthesis of dsRNA. We have constructed a recombinant plasmid that transcribed with T3 polymerase yields a positive sense RNA containing the rotavirus gene 11 5' and 3' untranslated regions, flanking the coding region of CAT reporter gene. This RNA is amplified when transfected into the cytoplasm of rotavirus infected cells. The results obtained in the study of 3' mutant RNAs have shown that the cis-acting signals to promote the synthesis of dsRNA involved, not only the 3' consensus sequence, but also a "stem-loop" structure and a single strand 3' end of 18 nt that include the 3' conserved termini. We couldn't obtain recombinant rotavirus using this methodology. It is possible that the packaging signals are not located in the 5' or 3' untranslated region of segment 11, but into the coding region, absent in the RNAs we have studied.

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Registro:
Título : Estudios moleculares del gen 11 de rotavirus     =    Molecular studies of Rotavirus Gene 11
Autor : Giambiagi, Susana
Director : Burrone, Oscar
Director Asistente : Frasch, Alberto Carlos C.
Año : 2001
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Fundación Campomar. Instituto de Investigaciones Bioquímicas (IIB)
International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (ICGEB)
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3391_Giambiagi
Idioma : Español
Area Temática : 
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