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Ver el documento (formato PDF)   Berretta, Marcelo Facundo.  "Dos nuevos genes de Beauveria bassiana : Una quitonasa y una proteína de transporte que podrían estar relacionados con la patogenicidad"  (2001)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
La búsqueda de genes relacionados con la patogenicidad de Beauveria bassiana, se llevó a cabo siguiendo la estrategia de estudiar la expresión de una cepa virulenta del hongo, cultivada in vitro, en condiciones nutricionales similares a las que este patógeno se encuentra sometido durante la penetración del hospedante. Para ello se utilizó como única fuente orgánica de crecimiento, una preparación de la cutícula del insecto Diatraea saccharalis, el sustrato natural cuya degradación es requerida para el establecimiento de la infección. Se aplicó la técnica de Differential display para la detección de genes que se expresaran en forma diferencial bajo esta condición. Por comparación entre los productos de amplificación de ADNc, obtenidos por RT-PCR del ARN extraído del hongo cultivado con cutícula, o sin ella, se detectaron fragmentos únicamente presentes en el primer caso. Los patrones de bandas se obtuvieron utilizando un primer oligo-dT, en combinación con decámeros de secuencia arbitraria. Se desarrolló una metodologia que consistió en la marcación de los productos de PCR con grupos fluorescentes, y su análisis en un sistema de secuenciación automática. Los fragmentos amplificados diferencialmente fueron utilizados como sondas, para estudiar el nivel de expresión de los transcriptos correspondientes, por la técnica de northern. Paralelamente, se determinó el número de copias de los genes respectivos, en el genoma de B. bassiana, mediante la técnica de southern. Se construyó una genoteca de ADN genómico de B. bassiana en un vector de sustitución derivado del fago λ. El screening de la misma con una sonda de expresión diferencial, permitió identificar un gen que codifica para una proteína deducida de 495 aminoácidos. La secuencia de la misma, presentó homología con una familia de proteínas de transporte a través de membrana, de especificidades diversas. Adyacente a dicho gen, en posición aguas arriba de la secuencia genómica, se identificó otro gen de copia única y de expresión concertada con el anterior, que codifica para la enzima quitosanasa. Con la secuencia del ADNc se comprobó la existencia de dos intrones en la estructura primaria del gen. La proteína deducida, de 232 aminoácidos, presenta 74% de identidad de secuencia con la misma enzima de otro hongo entomopatógeno, Metarhizium anisopliae. Otras tres secuencias fúngicas completan el grupo de quitosanasas eucariotas conocidas, separado de las enzimas de origen bacteriano, por análisis de agrupamiento en base a similitud de secuencia. Se propone la participación de esta enzima en la degradación de la cutícula de los insectos, por parte de los hongos entomopatógenos.

Abstract:
A virulent strain of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana was cultured in vitro under nutritional conditions resembling those encountered by the pathogen during penetration of the host. This strategy was followed to study the expression of fungal genes related to pathogenicity. The fungus was grown with the cuticle of the insect Diatraea saccharalis as the sole source of carbon and nitrogen. The degradation of this substrate is needed for the infection to be accomplished. The Differential display technique was used to detect genes that were differentially expressed under this culture condition. The cDNA amplification products obtained by RT-PCR of the mRNA extracted from the fungus cultured with, or without cuticle, were compared. By this means, fragments only present in the former condition, were detected. The banding patterns were obtained by using an oligo-dT primer in combination with 10-mer primers of arbitrary sequence. Original protocols were developed to perform the analysis on an automated DNA sequencer, through the incorporation of fluorescent labels in the PCR products. The differentially amplified fragments were used as probes to study the expression level of the corresponding genes by northern. The southern technique was used to estimate the copy number of the genes within the genome. A λ derived cloning vector was employeed in the construction of a genomic library of the fungus. The screening of this library with a differential probe allowed for the detection of a gene encoding a protein of 495 amino acids. The deduced sequence of this protein shows similarity to members of a family of membrane transporters with diverse specificities. Another gene is located immediately upstream. This one was also found to be overexpressed in culture on cuticle. It encodes the enzyme chitosanase. The cDNA sequence evidenced the existence of two introns in the primary structure of the gen. The deduced protein has 232 amino acids, and it shows 74% identity with the same enzyme of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae. The other three chitosanase genes from eukaryotic origin, which are known to date, belong to fungi. They cluster together and remain separate from the bacteria] proteins, when their sequences are compared. The enzyme produced by entomopathogenic fungal species is a good candidate to participate in the degradation of the insect cuticle

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Registro:
Título : Dos nuevos genes de Beauveria bassiana : Una quitonasa y una proteína de transporte que podrían estar relacionados con la patogenicidad    
Autor : Berretta, Marcelo Facundo
Director : Grau, Oscar
Año : 2001
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3397_Berretta
Idioma : Español
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