Tesis > Documento


Ver el documento (formato PDF)   Dus Santos, María José.  "Expresión de antígenos del virus de la fiebre aftosa en plantas de alfalfa transgénicas: su utilización como inmunógenos experimentales"  (2001)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
URL:
     
Resumen:
El uso de plantas transgénicas como sistema de expresión de antígenos relevantes ha sido ampliamente evaluado dada la posibilidad de utilizar plantas modificadas genéticamente para la producción de vacunas. Las vacunas a base de plantas serían más baratas y más fáciles de elaborar en grandes cantidades. Estas vacunas se podrían producir en países en desarrollo sin necesidad de instalaciones sofisticadas y costosas como las que se necesitan en la actualidad. Por otra parte, estas vacunas eliminarlanel riesgo de virus contaminantes que existe en las vacunas producidas en líneas celulares de mamíferos ya que los posibles vian de plantas contaminantes no constituyen un peligro potencial ni para el hombre ni para los animales. Adicionalmente, las plantas transgénicas que expresen antígenos en sus tejidos comestibles podrían ser usadas como sistemas de producciónde vacunas de administración oral. Hasta el momento, la mayoría de los antígenos expresados consisten en péptidos, proteínas únicas ó estructuras muy simples. Sin embargo, la producción de antígenos vacunales en sistemas heterólogos requiere, en muchos casos. ía expresión de estructuras antigénicas complejas. EIVirus de la Fiebre Aftosa (VFA)produce una de las enfermedades más temidas del ganado debido a su amplia distribucióngeográfica y por ser altamente contagiosa. La vacuna utilizada actualmente es polivalente y a virus inactivado. El progreso en la producción de vacunas antiaftosas está dirigido hacia el logro de vacunas de elaboración más fácily económica y que eviten la manipulación de grandes cantidades de virus. Una alternativa a las vacunas convencionales es la preparación de cápsides vacías expresando y procesando la poliproteína precursora en un sistema de expresión heterólogo. Se han obtenido cápsides vacías confonnacionalmente correctas de los serotipos A, 0 y C del VFA utilizando sistemas de expresion en E. CoIi, baculovirus o virus vaccinia. Los resultados obtenidos hasta ahora al expresar cápsides vacías del VFA en sistemas heterólogos, con relación a Ia conservación de epitopes protectivos, las convierten en antígenos candidatos para la formulaciónde vacunas. Sin embargo, aún no se ha logrado un método de expresión masiva de un inmunógeno eficaz como para ser utilizado a campo, ya que los sistemas desarrollados hasta ahora resultan costosos y poco aplicables a nivel industrial. Como primer objetivo de este trabajo de tesis se propuso producir plantas de alfalfa transgénicas conteniendo el gen que codifica para la poliproteína P1 precursora de las proteínas estructurales del VFA. Las construcciones utilizadas involucran únicamente a P1 ó a P1 junto con la proteasa SC. La presencia del gen foráneo se detectó, en las plantas transgénicas, por PCR y su actividad transcripcional específica por RT-PCR y Northern blot. Fue posible visualizar por microscopía electrónica estructuras que por su tamaño y morfología podrían corresponder a cápsides vacías del VFA. La inmunogenicidad de los productos expresados fue evaluada en el modelo murino. Ratones adultos inmunizados intraperitonealmente desarrollaron una respuesta de anticuerpos detectada por su reactividad. en ELISA, frente a un péptido sintetico que representa la zona más inmunogénica de VP1 y partículas virales completas; y, en Western blot, frente a las proteínas estructurales del virus nativo. Además, estos animales desarrollaron anticuerpos neutralizantes y resultaron completamente protegidos frente al desafío con virus infeccioso. Estos resultados demuestran la factibilidad de expresar antígenos altamente complejos en plantas transgénicas y su utilizacióncomo efectivos inmunógenos experimentales. Los resultados obtenidos por nuestro y otros grupos de investigación demuestran la factibilidad de la utilización de plantas transgénicas como fuente de producción de antígenos vacunales. Sin embargo, uno de los principales problemas que posee este sistema de expresión es que los niveles de proteína expresada en las plantas transgénicas son relativamente escasos como para extrapolar su uso a una vacuna de aplicabilidad real. De modo que, el desarrollo de estrategias que generen una mayor concentración de la proteína recombinante es sumamente importante, especialmente cuando se desea utilizar los extractos de planta sin ningún proceso de enriquecimiento y/o purificación posterior. Dado que la inserción del transgen en el genoma vegetal es al azar, es altamente probable que los niveles de su expresión varíen entre los individuos producidos. Una alternativa posible, entonces, consiste en poder identificar aquellos individuos que presentan niveles excepcionalmente altos de la proteina foránea. Sin embargo, la identificación de aquellas plantas que expresen cantidades significativas de antígeno por métodos inmunológicos es un proceso lento y labioroso. Teniendo en cuenta lo mencionado anteriormente, y como segunda parte de este trabajo de tesis, hemos desarrollado una metodologia que nos permite evaluar un gran número de individuos y seleccionar de un modo fácil y rápido aquéllos que presentan mayores niveles de expresión de la proteina recombinante. Esta metodologia se basa en la expresión de un gen de interés fusionado a un gen reportero, codificante para la enzima B-Glucuronidasa (B-GUS), cuya presencia puede ser detectada cuantitativamente por colorimetrla. A fin de evaluar el sistema de selección propuesto, utilizamos como antígeno un péptido que comprende los residuos 135 a 160 de la proteina VP1 del VFA para generar la proteina de fusión con la enzima B-GUS.Las plantas transgénicas obtenidas fueron primeramente evaluadas por su actividad enzimática de B-GUS. Fue posible detectar por Western blot la proteina de fusión en aquellas plantas que presentaron mayores niveles de B-GUS. Las plantas seleccionadas expresaron 0.5-1 pglmg de proteina soluble total. El péptido p135-160 expresado como proteina de fusión conservó sus caracteristicas inmunogénicas ya que ratones inmunizados parenteralmente con una vacuna elaborada con extracto foliar desarrollaron una respuesta de anticuerpos especificos detectada por su reactividad en ELISAfrente a p135-160, particulas virales completas y en Western blot frente a VP1. Además, se detectaron anticuerpos neutralizantes que resultaron protectores frente al desafio con virus infeccioso. Estos resultados demuestran la posibilidad de utilizaruna metodologia simple para detectar las plantas que expresan altos niveles del péptido recombinante, el cual conserva sus propiedades antigénicas e inmunogénicas al ser expresado como proteina de fusión.

Abstract:
The use of transgenic plants as a system for expressing recombinant antigens has already been widely evaluated and constitutes a feasible methodology for vaccine production. Plant based vaccines would be less expensive and easier to be produced in large scale. These vaccines could be produced in undeveloped countries without requiring sophisticated facilities, as they are currently needed. On the other hand, the use of these vaccines would eliminate the risk of contaminating viruses present in mammalian cellular lines since the plant contaminating viruses do not constitute an actual risk for animals or humans. Additionally,edible transgenic plants expressing antigens in their tissues could be used as oral vaccines. Up to now, most antigens expressed in plants are peptides, unique proteins or very simple structures. Nevertheless, production of vaccine antigens in heterologous systems often require the expression of complex antigenic structures. Foot and mouth disease virus is the causal agent of a worldwide distributed highly contagious disease of cattle. The currently used vaccine is based in the utilization of polyvalent inactivated virus. In general, progress in the process of FMDV vaccine production are pointed toward the development of simpler and cheaper protocols involving the use of lower amount of virulent viruses. An alternative to the conventional FMDV vaccines are those containing recombinant virus empty capsids after the expression of the precursor polyprotein.In the past, it has been possible to obtain empty capsids of serotypes 0, A and C using as expression systems E. coli, baculovirus and vaccinia virus. Although the products resulted immunogenically efficient, the methodologies for producing them are not suitable to be used at the industrial level. The first objective of this thesis was the production of transgenic plants of alfalfa containing the gene encoding for the polyprotein P1, which is the precursor of all structural FMDV proteins. The transgenic constructs used contained either just P1 nor P1 along with the 3C gene. The presence of the foreign gene in the recombinant plants was detected by PCR and their transcriptional activity analyzed by RT-PCR and Northen blot. Additionally. it was possible to demonstrate, by electron microscopy, the presence of structures with a size and shape resembling those of the FMDV empty capsides. The immunogenicity of the obtained products was evaluated in mice. Intraperitoneally immunized adult mice presented a FMDVantibody response detected by its activity,in ELlSA, against a synthetic peptide representing the major immunogenic area of VP1, and against complete virus particles, and in Western blot, against all the FMDV structural proteins. Additionally, these animals developed a significant neutralizing antibody response and protection when experimentally challenged with the virulent virus. These results demonstrated the feasibility of expressing highly complex structures in transgenic plants and its use as effective experimental immunogens. As stated earlier, results obtained by us and other research groups demonstrated the potential feasibility of using transgenic plants as a source of antigen for vaccine production. Nevertheless, the main problem presented by this approach resides in the relatively low concentration of the recombinant protein in the plant tissues, which hampers its possible utilization at the industrial scale. Thus, the development of strategies which allow the production of transgenic plants expressing high levels of recombinant protein would substantially modify the expectations on the utilization of this system in the future, specially in those cases where no further steps toward the enrichment or purification of the recombinant product will be needed. Due to the fact that the insertion of the transgene in the plant genome is a random process, it is expected the development of individuals presenting very different expression levels of the recombinant protein. An interesting approach could be the identification of those individuals presenting exceptionally high levels of the foreign protein. Nevertheless, the identification of those individuals,using immunological approaches, is usually a laborious and slow process. Focusing in this particular problem, the second part of this thesis deals with the development of a methodology that allows us to evaluate a significant number of individuals and select, in an easy and quick way, those presenting the highest levels of expression of the foreign protein. The methodology is based in the expression of the gene of interest as a fusion protein along with a reporter gene which encodes for the enzyme ß-Glucuronidase (ß-Gus), which could be quantitatively detect by a oolorimetric test. In order to evaluate this methodology, we selected as antigen a peptide which represent the amino acid residues at position 135 to 160 of the structural FMDV protein VP1. This peptide was expressed as a fusion protein along with ß-Gus. The obtained transgenic plants were first evaluated based in their ß-Gus activity. Among those presenting the highest enzymatic activity it was possible to detect, by Western blot, the presence of the FMDV epitope. The selected plants expressed a concentration of the recombinant protein between 0.5 to 1 mg/g of the total soluble protein extracted for the plant tissue. The peptide 135-160 appears as conserving its native immunogenic characteristic since adult mice parenterally immunized with a vaccine prepared with the foliar extracts developed a specific FMDV antibody response detected in ELISA, against the p135-160 synthetic peptide. and complete virus particles, and against native VP1 in Western blot. Additionally,the sera of these animals showed significant neutralizing antibodies titers and the mice resulted protected against the experimental challenge with infectious virus. These results demonstrate the feasibility of using this simple methodology to detect transgenic plants expressing high levels of recombinant peptide, which completely conserves its antigenic and immunogenic properties when expressed as a fusion protein.

* A este resumen le pueden faltar caracteres especiales. Consulte la versión completa en el documento en formato PDF

Registro:
Título : Expresión de antígenos del virus de la fiebre aftosa en plantas de alfalfa transgénicas: su utilización como inmunógenos experimentales     =    Expression of foot and mouth disease virus antigens in alfalfa transgenic plants : its use as experimental inmunogens
Autor : Dus Santos, María José
Director : Borca, Manuel V.
Director Asistente : Carillo García, Consuelo
Año : 2001
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) Castelar. Instituto de Investigaciones en Ciencias Veterinarias y Agronómicas (CICVYA). Instituto de Virología
Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) Castelar. Instituto de Investigaciones en Ciencias Veterinarias y Agronómicas (CICVYA). Instituto de Genética
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3402_DusSantos
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Agrobiotecnología
Biología / Virología
Biología / Ingeniería Genética
URL al Documento : 
URL al Registro : 
hola chau _gs.DocumentHeader_ chau2 _documentheader_ chau3
Estadísticas:
     http://digital.bl.fcen.uba.ar
Biblioteca Central Dr. Luis Federico Leloir - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires
Intendente Güiraldes 2160 - Ciudad Universitaria - Pabellón II - C1428EGA - Tel. (54 11) 4789-9293 int 34