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Ver el documento (formato PDF)   Berenstein, Mariana G..  "Diseño, caracterización, producción y utilización de vectores virales y plasmídicos para terapia génica del cáncer"  (2001)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
La transferencia in vivo del gen de la timidina kinasa del virus herpes-1 seguido por la administración de la prodroga ganciclovir (HSV-tk/GCV) y su posterior activación in situ, surgió como una estrategia de terapia génica eficaz para el tratamiento de tumores experimentales y humanos. Se había demostrado la existencia de un efecto “bystander” por el cuál las células no modificadas por el gen también eran eliminadas por GCV activado por el gen HSV-tk. Sin embargo, su validez fue cuestionada desde diferentes perpectivas, entre ellas el sistema de transferencia y el modelo tumoral utilizado. Dada la disparidad de resultados en diferentes modelos experimentales, construimos un vector retroviral conteniendo el gen de HSV-tk y obtuvimos células productoras de vectores retrovirales (VPC). Utilizando dichas células como fuente de tranferencia génica, estudiamos la eficiencia de transducción in vivo en células malignas sobre tres modelos tumorales distintos: melanoma murino B16, melanoma humano IIB-MEL-LES y glioblastoma de rata C6. En estudios in vitro pudimos observar un efecto bystander sólo en células C6. Los estudios in vivo mostraron una inhibición del crecimiento tumoral en los dos modelos de melanoma cuando las células eran co-inoculadas con VPC productoras de vectores retrovirales portando el gen HSV-tk (VPC-tk) y tratadas con GCV. Sin embargo, el 100% de los animales fue capaz de desarrollar tumores en ambos modelos . Bajo las mismas condiciones experimentales, 70% de las ratas fueron capaces de rechazar células de glioma C6 transferidas de modo intracraneal por técnicas estereótaxicas y el 50% de los animales mostró un aumento significativoen el tiempo de sobrevida. El tratamiento de tumores C6 establecidos con VPC-tk y GCV, llevó a la cura del 33% de los animales. Las ratas que rechazaron el tumor primario fueron capaces de desarrollar una respuesta inmune de memoria que lleva al rechazo de desafíos contralaterales con células parentales. A los efectos de aumentar el efecto terapéutico estudiamos el efecto antitumoral de la tranferencia del gen de interleuquina-12 solo o en combinación con el gen HSV-tk y tratamiento con GCV, sobre tumores de cerebro intracraneales y los mecanismos involucrados en el rechazo tumoral. Luego de la transferencia i.c.de células productoras VPC-IL12, se lograba suprimir el crecimiento de tumores C6, aún en tumores establecidos de 10 días. La combinación con células VPC-tk y GCV tuvo mejor efecto terapéutico que los dos tratamientos por separado sobre tumores incipientes. Los estudios de los mecanismos asociados a la respuesta antitumoral demostraron la participación de eventos inmunológicos y no inmunológicos. Secciones histológicas de cerebros con expresión local de IL-12 mostraron una activación inmediata de macrófagos/microglia y su reclutamiento a áreas intratumorales. La expresión de IL-12 también fue capaz de estimular un reclutamiento de PMN e inducir necrosis de vasos tumorales, mientras los vasos del parénquima normal no se vieron afectados. Por otro lado, el tratamiento con HSV-tk/GCV mostró un infiltrado mayoritario de células CD5+. Además, únicamente la combinación de IL-12 y HSV-tk/GCV fue capaz de reclutar células CD4+ y CD8+ cuando el tratamiento era aplicado a tumores de gran tamaño. Los animales sobrevivientes desarrollaron una inflamación crónica en el sitio de inyección primario compuesto de macrófagos y linfocitos en distintas proporciones según el tipo de terapia inicial aplicado. Este infiltrado crónico no fue perjudicial para el cerebro ya que no se observaron evidencias de desmielinización ni tampoco daños neurológicos asociados. Por lo tanto este estudio provee las bases para comprender los mecanismos involucrados en la respuesta antitumoral inducida por IL-12, sola o en combinación con el sistema del gen suicida y apoya el uso de la terapia combinada para el tratamiento de tumores de cerebro. Un clon de VPC terapéutico portando el gen de HSV-tk fue también seleccionado para su utilización en protocolos clínicos. Este clon mostró una mayor eficacia antitumoral que la preparación original. Finalmente, se construyeron y caracterizaron nuevos vectores para su uso en terapia génica, basados en sistemas regulables e inducibles por condiciones exógenas (tetraciclina) y endógenas del tumor (hipoxia tumoral).

Abstract:
In vivo transfer of the herpes simplex virus thymidine kinase gene followed by ganciclovir administration (HSV-tk/GCV) and in situ activation of the prodrug, has evolved as an effective approach to the treatment of tumors of experimental and human origin. In vitro studies were able to demonstrate the development of a“bystander effect" that led to the death of cells that do not express the gene, in the presence of GCV activated by HSV-tk modified cells. However, several studies have questioned the validity of this approach, mainly in terms of the gene transfer system being used and the experimental model to which they applied. Considering the different results that were reported on different experimental tumor models, we made a retroviral vector containing the HSV-tk gene and retroviral vector producer cells (VPC) were obtained. By using these (VPC) as a source for in vivo gene transfer we evaluated the efficacy of in vivo transduction of malignant cells using three different tumor cell models: 816 murine and IIB-MEL-LES human melanomas, and C6 rat glioblastoma. In vitro studies have shown a bystander effect only in C6 cells. In vivo studies showed an inhibition of tumor growth in the two melanoma models when tumor cells were co-injected with VPC producing retroviral vectors carrying the HSV-tk gene (VPC-tk), followed by GCV treatment, but 100% of mice developed tumors in both models. Under similar experimental conditions, 70% of syngeneic rats completely rejected stereotactically transferred C6 tumor cells and 50% of them showed a prolonged_survival. Treatment of established C6 tumors with VPC-tk and GCV led to cure of 33% of the animals. Rats which rejected tumor growth developed an anti-tumor immune memory leading to rejection of a stereotactic contralateral challenge with parental cells. In order to increase the therapeutic efficacy of the system we studied the antitumoral response after interleukin-12 (IL-12) gene transfer alone or in combination with the herpes virus thymidine kinase gene/gancyclovir (HSVtk/GCV), on i.c. implanted brain tumors and the underlying mechanisms mediating tumor rejection. Following i.c. transplantation of retroviral vector producer cells (VPC) VPC-IL12 were able to suppress rat C6 glioma tumor growth even when rats carried 10 days-old tumors. Its combination with VPC-tk had better therapeutic effect than each single treatment on incipient tumors. The study of the mechanisms involved in the antitumoral response, clearly showed that it was mediated by immune and no immune mechanisms. IL-12 expression was characterized by the immediate activation of microglia/macrophage and their recruitment to the intratumoral area. IL-12 expression also stimulated PMN recruitment and induced tumor vessel necrosis, while normal brain vessels remained intact. Conversely, CD5+ lymphocytes were the main immune cell type recruited by HSV-tk/GCV. In addition, only the combination of IL-12 and HSV-tk/GCV was able to recruit CD4+ and CD8+ when large tumors were treated. Surviving rats developed a chronic inflammation at the site of injection composed of macrophages and lymphocytes which was not harmful to the brain since no demielynization or neurological signs were observed. The present study provides a basis to understand the mechanisms underlying the antitumor response induced by IL-12 alone and in combination with HSV-tk/GCV and supports their use in combination therapy of brain tumors We also selected a therapeutic clone of VPC carrying the HSV-tk gene for its clinical application. This clone showed a higher antitumor efficacy than the original cell preparation. Finally, new gene therapy vectors, based on systems regulated by exogenous (tetracycline) and endogenous (tumor hypoxia) conditions, were developed and further characterized

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Registro:
Título : Diseño, caracterización, producción y utilización de vectores virales y plasmídicos para terapia génica del cáncer    
Autor : Berenstein, Mariana G.
Director : Podhajcer, Osvaldo
Director Asistente : Pitossi, Fernando
Año : 2001
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Instituto de Investigaciones Bioquímicas "Fundación Campomar"
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3412_Berenstein
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Biomedicina
Palabras claves : TERAPIA GENICA; TIMIDINA KINASA DEL VIRUS HERPES (HSV-TK); INTERLEUQUINA-12; CANCER; TUMORES DE CEREBRO; TETRACICLINA; HIPOXIA; GENE THERAPY; HERPES SIMPLEX VIRUS THYMIDINE KINASE; INTERLEUKIN-12; CANCER; BRAIN NEOPLASM; TETRACYCLINE; HYPOXIA
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