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Ver el documento (formato PDF)   Alonso, Guillermo Daniel.  "La arginina quinasa de Trypanosoma cruzi : Estudio de su regulación y utilización de modelos transgénicos"  (2002)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
La arginina quinasa cataliza la transferencia reversible de un grupo fosfato entre el ATP y la L-arginina. En este trabajo se reporta modelos de sobre-expresión exitosos para una enzima endógena, como es el caso de la arginina quinasa. Se obtuvieron 60 veces de sobre-expresión, utilizando el vector de expresión de alta eficiencia pTREX-A. La población transfectada con la arginina quinasa presentó un aumento en la densidad celular y en la tasa de replicación, sugiriendo que los fosfágenos podrían estar involucrados en la división celular. Además, la actividad arginina quinasa aumento continuamente durante la fase exponencial de crecimiento. Se observó una correlación entre la tasa de crecimiento, la actividad arginina quinasa y los niveles de enzima. En el rango de tiempo de cultivo estudiado, los niveles de ARNm mostraron solo cambios menores. La sobreexpresión de la arginina quinasa presentó una cinética de degradación a lo largo de la curva de crecimiento coincidente con el aumento de la enzima endógena y de la actividad, indicando una posible regulación por proteólisis. La incorporación de arginina fue estudiada en epimastigotes de Trypanosoma cruzi durante las fases del cultivo in vitro. La incorporación de arginina disminuyó continuamente desde el 3ro al 14to día. Estas variaciones pueden ser reproducidas utilizando medio condicionado o medio fresco. El ayuno de arginina, la densidad celular y la disponibilidad de Fuentes de carbono, también afectaron la incorporación. En tripomastigotes, el estadio infectivo no replicativo, la actividad y expresión arginina quinasa fueron 2.2 veces superior a la correspondiente a epimastigotes del 7mo día, y la incorporación de arginina fue al menos 30 veces menor en tripomastigotes que en epimastigotes del 7mo dia. Además una disminución reversible del 40 % de la arginina incorporada fue observado cuando células del día 3 fueron tratadas con el agente antimitótico, hidroxi urea. Estos resultados sugieren una relación entre la incorporación de arginina, la tasa de duplicación celular, y el aumento en la actividad arginina quinasa.

Abstract:
Arginine kinase catalyzes the reversible transphosphorylation between ATP and L-arginine. This work reports one of the first successful over-expression models of an endogenous enzyme, such as arginine kinase. Thus, it was obtained a 60-fold over-expression using the high-efficiency expression vector pTREX-A. The cells transfected with arginine kinase showed an increase in cell density and replication rate, suggesting that phosphagens could be involved in cell division. Furthermore, the arginine kinase activity was increased continuously during the exponential phase of growth. A correlation between growth rate, enzyme-specific activity and enzyme protein was observed. In the whole range of the culture time mRNA levels showed minor changes. Overexpressed arginine kinase has a degradation kinetics along the parasite growth curve coincident with the increment of the endogenous enzyme protein and activity, indicating that arginine kinase activity might be regulated by proteolysis. Arginine uptake was measured in Trypanosoma cruzi epimastigote cells along the in vitro culture growth phases. Arginine uptake decreased continuously from the 3rd to the 14th day. These fluctuations could be resembled using conditioned or fresh medium. Arginine starvation, cell density and carbon source availability also affect the arginine uptake. In trypomastigote cells, the infective and nonreplicative stage, arginine kinase activity and expression were 2.2-fold higher than 7th-day epimastigote activity, and arginine uptake was at least 30-fold lower in trypomastigote than 7th-day epimastigote forms. Moreover, a reversible 40% decrease of the arginine uptake was observed when 3rd-day cells were treated with the antimitotic hidroxyurea. These results suggest a correlation between arginine uptake, the cell replication rate, and the increase in the arginine kinase specific activity.

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Registro:
Título : La arginina quinasa de Trypanosoma cruzi : Estudio de su regulación y utilización de modelos transgénicos     =    Trypanosma cruzi arginine kinase : study of its regulation and use of transgenic models
Autor : Alonso, Guillermo Daniel
Director : Flawiá, Mirtha M.
Año : 2002
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular (INGEVI)
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3441_Alonso
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Biología Molecular y Celular
Palabras claves : FOSFAGENOS; ARGININA QUINASA; TRYPANOSOMA CRUZI; GUANIDINO QUINASA; FOSFOARGININA; TRANSPORTE DE ARGININA; INCORPORACION DE ARGININA; PHOSPHAGEN; ARGININE KINASE; TRYPANOSOMA CRUZI; GUANIDINO KINASE; PHOSPHOARGININE; ARGININE TRANSPORT; ARGININE UPTAKE
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