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Ver el documento (formato PDF)   Asurmendi, Sebastián.  "Desarrollo y aplicación de un sistema de expresión de poliproteínas autoclivables basado en la proteasa NIa del virus TEV para la obtención de plantas transgénicas con capacidad de procesar, secretar y dirigir subcelularmente las proteínas expresadas"  (2002)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
Se desarrolló, perfeccionó y evaluó la factibilidad de aplicación práctica de un vector de transformación genética vegetal que permite la coexpresión de varias proteínas bajo el control de un promotor común. El sistema desarrollado basado en la proteasa NIa derivada del TEV fue capaz de procesar poliproteínas quiméricas y producir la acumulación de varias proteínas a partir de una única unidad transcripcional in vivo. Se expresaron diferentes combinaciones de proteínas (indicadoras, como GFP y GUS, cápsides de PVX, PVY y PLRV, así como proteínas de defensa antifúngica) in vivo e in vitro. El nivel de acumulación de cada proteína no dependió de la posición del ORF en la poliproteína. A pesar de lo expuesto el nivel de acumulación total de una proteína expresada a través de la poliproteína puede ser influenciada por propiedades intrínsecas de las mismas. Mediante microscopía electrónica se demostró que la cápside de PVY expresada a través de la poliproteína no sólo se procesa correctamente sino que el producto del procesamiento es capaz de formar partículas parecidas a virus (cápsides vacías). Cuando se agregó la señal de exportación al RE del gen de la patatina a poliproteínas conteniendo GUS y GFP, éstas fueron dirigidas al RE en protoplastos de tabaco de la línea BY-2. Las plantas transgénicas de papa expresando estas poliproteínas mostraron menor actividad GUS que las plantas control expresando la misma poliproteína pero sin señal de exportación. Este menor nivel de actividad podría ser atribuido a que la proteína GUS resulta glicosilada en el RE. Estos resultados sugieren que la poliproteína es dirigida al RE y luego en el lumen procesada para liberar las proteínas individuales. Se obtuvieron plantas de papa transgénica expresando poliproteínas conteniendo cuatro genes antifúngicos, codificantes para una quitinasa, una glucanasa, AP24 y RIP. Se obtuvieron plantas altamente resistentes a el ataque de R. solani, demostrando el correcto procesamiento de la poliproteína y el sinergismo de las proteínas antifúngicas expresadas para producir resistencia. Se encontró una asociación entre el espacio subcelular de acumulación de las proteínas glucanasa y AP24 (vacuolar versus apoplásmico) con el nivel de resistencia contra Rhizoctonia.

Abstract:
Development, characterization, as well as practical application of a plant transformation vector allowing the coexpression of different proteins under the control of a single promoter, is described. The system, based on NIa protease gene derived from tobacco etch potyvirus was shown to express and process chimerical polyproteins and to accumulate different proteins from a single transcription unit, including reporter genes (green fluorescent protein —GFP-and β-glucurunidase —GUS-), as well as coat proteins of potato virus Y (PVY), potato virus X (PVX) and antifungal proteins. Thus, different combinations of proteins were expressed in vitro or in vivo showing that protein accumulation does not depend upon relative position of the ORF within the cassette. However, the overall level of accumulation may be influenced by intrinsic properties of the expressed proteins. Electron microscopy showed that the PVY CP expressed in the polyprotein cassette assembled in vivo to form void virus-like-particles. Addition of the endoplasmic reticulum (ER) targeting sequence from patatin to the polyprotein containing GUS and GFP, targeted the protein to ER, in BY-2 tobacco protoplasts. Transgenic plants that encode the thus polyprotein exhibited lower enzymatic activity than transgenic plants expressing GUS from the cassette without the patatin leader sequence. Indirect evidence suggests that the low level of activity is the result of glycosylation of GUS in the ER. These results suggest that the polyprotein is first targeted to the ER where the polyprotein is processed to release the individual proteins. Transgenic potato plants expressing a polyprotein including four anti-fungal ORFs (chitinase, glucanase, AP24 and a RIP) were produced. High levels of protection against Rhizoctonia solani attack were shown, confirming the correct processing and synergism of these proteins to produce resistance. We found an association between the subcellular localization of the introduced glucanase and the level of resistance. Protein AP24 showed a similar but less apparent behavior. We conclude that the vector system pPRO10/20 is highly effective to express several proteins in planta. The expressed proteins can be, cytoplasmic or exported to the apoplasm or other subcellular compartments like vacuoles.

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Registro:
Título : Desarrollo y aplicación de un sistema de expresión de poliproteínas autoclivables basado en la proteasa NIa del virus TEV para la obtención de plantas transgénicas con capacidad de procesar, secretar y dirigir subcelularmente las proteínas expresadas    
Autor : Asurmendi, Sebastián
Director : Hopp, Horacio Esteban
Año : 2002
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) Castelar. Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias (CNIA). Instituto de Biotecnología
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3451_Asurmendi
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Ingeniería Genética
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