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Ver el documento (formato PDF)   Franco, Paula Gabriela.  "Rol del ácido retinoico durante la neurogénesis primaria de Xenopus Laevis"  (2002)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
El primer paso para la construcción del sistema nervioso de los vertebrados es la formación de la placa neural. Varios reportes sugieren que la señal retinoide es esencial para el establecimiento normal del patrón neural y la diferenciación neuronal. Aunque se ha progresado mucho en este sentido, quedan aún muchas preguntas sin respuestas para tratar de elucidar el rol que los retinoides juegan durante el desarrollo embrionario. En este trabajo, dentro del contexto de la cascada de la neurogénesis primaria de Xenopus laevis, exploramos la habilidad de los retinoides de regular diferentes pasos de la cascada que lleva a la diferenciación neuronal. Mostramos que el tratamiento con ácido retinoico (RA) produjo un sustancial aumento en el número de neuronas primarias que expresan N-tubulina debido a un incremento de la diferenciación neuronal sin involucrar cambios en la proliferación o muerte celular programada. Las evidencias indican que este efecto se origina en los pasos iniciales de la cascada neurogénica, ya que este tratamiento alteró el balance entre dos genes de prepattern de expresión temprana. Por un lado, se observó inducción de la expresión de Gli3, que promueve el destino neuronal y por otro, inhibición de Zic2, un represor de la neurogénesis. Además, se modificó la expresión de otros marcadores que participan en los pasos intermedios de la cascada como Neurogenina, MyT1 y X-Delta-1. Paralelamente, determinamos que los retinoides reprimen la expresión de sonic hedgehog (shh) en la línea media del embrión tanto en la placa del piso como en la notocorda y establecímos por primera vez un nexo entre shh, el RA y la neurogénesis primaria. En experimentos de rescate fenotípico demostramos que el RA no es capaz de revertir el efecto inhibitorio de shh, Zic2 o una versión costitutivamente activa de Notch (NotchICD) sobre la neurogénesis primaria. Estos resultados, junto con el hecho de que un pulso corto de RA alrededor del comienzo de la gastrulación es suficiente para desencadenar la inhibición de la expresión de shh, sugieren que el RA participa muy tempranamente en la regulación de esta vía. El tratamiento con agonistas y antagonistas selectivos de los receptores de ácido retinoico (RAR) nos permitió, por un lado, confirmar que la activación de los RAR es suficiente para inhibir la expresión de shh e inducir la neurogénesis y por otro, determinar que RARα es necesario in vivo tanto para regular la expresión de shh, como para establecer el patrón normal de neuronas primarias. Mediante una estrategia de dominancia negativa establecimos que el receptor RARα1 es requerido para la correcta regulación de shh, ya que cuando se interfiere con su función, la expresión de shh se desinhibe. Finalmente, el bloqueo específico de la síntesis de RARγ1 por microinyección de un oligo morfolino antisentido produjo un aumento muy marcado de la expresión de shh, sugiriendo que esta isoforma también es necesaria para mediar la regulación negativa que los retinoides ejercen sobre la expresión de shh. Contrariamente, mostramos mediante esta misma estrategia, que el receptor RARα2.2 no es necesario para ejercer in vivo esta regulación. Todos estos resultados en conjunto proveen nuevas evidencias que profundizan la comprensión del rol de los retinoides durante el desarrollo embrionario, en particular durante la neurogénesis primaria y aportan herramientas críticas para ayudar a descifrar los mecanismos moleculares que determinan la construcción en espacio y tiempo de la placa neural.

Abstract:
The first step in making the nervous system of a vertebrate is the segregation of the neural plate. Several reports suggest that retinoid signal is essential for normal neural patterning and neuronal differentiation. Although there was a lot of progress in this way, many questions remain without answers to elucidate the role that retinoids play during development. In this work, inside the context of Xenopus laevis primary neurogenesis cascade, we explored retinoid's ability to regulate different steps of the cascade that lead to neuronal differentiation. We show that retinoic acid (RA) treatment produced a substantial induction in the number of primary neurons that express N-tubulin due to a promotion of neuronal differentiation without involving changes in proliferation or programmed cell death. Evidences indicate that this effect originates in the initial steps of neurogenic cascade, as this treatment altered the balance between two prepattern genes with early expression. By one side, we observed an induction in Gli3 expression, a promotor of neuronal fate and by the other side, inhibition of Zic2, a repressor of neurogenesis. Furthermore, the expression of other markers that participate in the intermediate steps of the cascade, as neurogenin, MyT1 and Delta-1, was also modified. At the same time, we determined that retinoids repressed sonic hedgehog (shh) expression in the embryo midline, both in the floor plate as well as in the notochord and we established for the first time a link between shh, RA and primary neurogenesis. In phenotypic rescue experiments, we show that RA is not capable to reverse the inhibitory effect caused on primary neurogenesis by shh, Zic2 or a constitutively active form of Notch (Notch ICD). These results, together with the fact that a short RA pulse near the beginning of gastrulation is sufficient to inhibit shh expression, suggest that RA participate very early in the regulation of these processes. The treatment with selective agonists and antagonist of RA receptors (RAR) allowed us, first, to confirm that RAR activation is sufficient to inhibit shh expression and to induce neurogenesis, and second, to determine that RARα is required for proper shh regulation, as when we interfered with its function, shh inhibition was lost. Finally, the specific blockade of RARγ1 synthesis, by microinjection of a morpholino antisense oligo, produced a great induction of shh expression suggesting that this isoform is also necessary to mediate the negative regulation that retinoids exert over shh expression. On the contrary, we showed by the same strategy, that RARα2.2is not required for this regulation in vivo. All these results together, provide new evidences to understand the role that retinoids play during development, particularly during primary neurogenesis and contribute with critical tools to decipher the molecular mechanisms that lead to neural plate construction in space and time.

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Registro:
Título : Rol del ácido retinoico durante la neurogénesis primaria de Xenopus Laevis     =    Retinoic acid role during Xenopus Laevis primary neurogenesis
Autor : Franco, Paula Gabriela
Director : Carrasco, Andres
Año : 2002
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencia
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3453_Franco
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Neurociencias
Biología / Bioquímica
Palabras claves : ACIDO RETINOICO; RA; NEUROGENESIS; INDUCCION NEURAL; HIBRIDIZACION IN SITU; XENOPUS LAEVIS; DESARROLLO EMBRIONARIO; PLACA NEURAL; DIFERENCIACION CELULAR; SONIC HEDGEHOG; RECEPTOR DE ACIDO RETINOICO; RAR; DOMINANTE NEGATIVO; SOBREEXPRESION; OLIGOS MORFOLINOS; RETINOIC ACID; RA; NEUROGENESIS; NEURAL INDUCTION; IN SITU HIBRIDIZATION; XENOPUS LAEVIS; EMBRYO DEVELOPMENT; NEURAL PLATE; CELLULAR DIFFERENTIATION; SONIC HEDGEHOG; RETINOIC ACID RECEPTOR; RAR; DOMINANT NEGATIVE; OVEREXPRESSION; MORPHOLINO OLIGOS
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