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Ver el documento (formato PDF)   Pascuccelli, Verónica.  "Caracterización molecular y bioquímica de una nueva proteína quinasa de Trypanosoma cruzi"  (1997)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
En los organismos eucariotas, la regulación de las complejas interacciones requeridas para la diferenciación y proliferación, está mediada en parte por los sistemas de fosforilación de proteínas. En Trypanosoma cruzi, se han podido caracterizar varias vías de transducción de señales a partir de la identificación y caracterización de sus distintos componentes como proteínas quinasas (PKA, PKC, Cam quinasa, CDK), adeninililciclasa (AC) y proteína G, entre otros. Dentro de la familia de las serina/treonina quinasas, recientemente ha sido identificada una nueva subfamilia de quinasas Llamadas RAC o PKB, cuya principal característica radica en la similitud de identidad que existe a nivel de su secuencia aminoacídica con PKA y PKC por igual. Estas proteínas han sido identificadas en células de mamíferos, Drosophila melanogaster, Caenorabhditis elegans, Dyctiostelium discoideum y Entamoeba histolytica pero no han sido aún detectadas en ningún tripanosomátido. Por lo tanto, nos hemos propuesto clonar el o los genes que codifican para esta nueva proteína quinasa en T. cruzi, para su posterior caracterización molecular y bioquímica y si es posible dilucidar su probable rol in vivo. Como resultado, hemos clonado el gen que codifica para una proteína quinasa RAC homóloga (PKTc), cuyo tamaño es de 1287 pb y codifica para una proteína de 428 aminoácidos. Esta proteína mostró tener entre un 60 y un 70% de homología con otras RAC quinasas. La PKTc recombinante es capaz de fosforilar a la histona IIAS, y de autofosforilarse, fosforilando específicamente residuos de treonina en ambos casos. Utiliza ATP como dador de fosfatos, requiere exclusivamente Mn²+ para su actividad, su valor de pH óptimo es entre 6-8 y su temperatura óptima es de 37°C. El Km aparente para el ATP resultó ser de 1.6 μM. La presencia de diferentes activadores (Ca²+/Cam) o inhibidores (PKI, H7, GF, staurosporina) no mostró tener un efecto significativo sobre su actividad. Experimentos de inmunolocalización utilizando anticuerpos contra la proteína recombinante, demostraron que la enzima se encuentra anclada en la membrana posiblemente, a través de ácido palmítico. Por otro lado, a través de experimentos de Western blot pudimos establecer que la PKTc está presente en los estadios de amastigote, epimastigote y tripomastigote metacíclico sin mostrar un patrón de expresión diferencial, que demuestra que esta proteína sería de carácter constitutivo. Experimentos de inmunoprecipitación nos permitirán en el futuro, identificar otras proteínas que interactúan con PKTc in vivo y dilucidar así la vía de transducción de señales en la que PKTc estaría involucrada.

Abstract:
In eucariotes, the regulation of the complex interactions required for differentiation and proliferation, is partially control by protein phosphorylation. The characteristics of several signal transduction pathways have been described in Trypanosoma cruzi from the dentification and characterization of several components such as protein tinases (PKA,PKC, Cam kinase, CDK), adenylyl cyclase (AC), protein G. Recently, a new subfamily of serine/threonine kinases have been identified, called RAC or PKB, which are closely related to PKC and PKA families at their aminoacidic sequences. This proteins have been identified in mammals cells, Drosophila melanogaster, Caenorabhditis elegans, Dyctiostelium discoideum and Entamoeba histolytica but they haven’t been detected yet in trypanosomatids. So, our objective was the cloning of the gene/s that codifies for these new protein kinase in T. cruzi, its later characterization at the molecular and biochemical level and if it’s possible, elucidate its function in vivo. As results, we cloned the gene that codifies for a protein kinase RAC homolog (named PKTc), with an open reading frame of 1287 pb that corresponds to a protein of 428 aminoacids long. This protein shares 60-70% homology with other RAC proteins. The recombinant PKTc can phosphorylate histone IIAS and itself, in both cases, exclusively in threonine residues. Uses ATP as phosphate donor, requires Mn²+ exclusively for its activity, the optime pH is neutral (6-8) and the optime temperature is 37°C. The apparent Km for the ATP is 1.6 μM. The presence of different activators (Ca²+/Cam) or inhibitors (GF, H7, staurosporine, PKI) did not affect the kinase activity significatly. Experiments of inmunolocalization using antibodies against the recombinant enzyme showed that PKTc is anchored to a membrane probably by a palmitic acid. Western blots experiments were done in order to investigate the differential expression of PKTc during the different stages of the life cycle of T. cruzi. The results demonstrated that this enzyme is present in the 3 stages (amastigote, epimastigote, metacyclic trypomastigote), without a differential expression pattern, so we supposed that it’s a constitutive protein. In the future, inmunoprecipitation experiments will allow us to identified other proteins that could interacted with PKTc in vivo and elucidate the signal transduction pathway in which this enzyme is involved.

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Registro:
Título : Caracterización molecular y bioquímica de una nueva proteína quinasa de Trypanosoma cruzi     =    Molecular and biochemical characterization of a new protein kinase in trypanosoma cruzi
Autor : Pascuccelli, Verónica
Director : Parodi, Armando J.
Año : 1997
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Instituto de Investigaciones Bioquímicas "Fundación Campomar"
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3461_Pascuccelli
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Bioquímica
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