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Ver el documento (formato PDF)   Carrillo, Carolina.  "Metabolismo de las poliaminas y su regulación en parásitos tripanosomatidos : expresión del gen de la Ornitina decarboxilasa (ODC) de C. fasciculata en T. cruzi"  (2002)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
Trypanosoma cruzi es el agente causal del “Mal de Chagas”, enfermedad endémica en América Latina. Este parásito unicelular, al igual que otros parásitos tripanosomátidos, presenta un complejo ciclo de vida a través de diferentes hospedadores (insecto vector - hospedador vertebrado). A lo largo de su ciclo el parásito pasa por distintos estadios celulares, sufriendo profundos cambios morfológicos, fisiológicos y bioquímicos que le permiten adaptarse a los distintos ambientes. Uno de los estadios, el epimastigote, no es infectivo para el hospedador vertebrado y presenta una capacidad proliferativa que permite su cultivo en el laboratorio sin mayores dificultades. Trypanosoma cruzi presenta numerosas características metabólicas que lo diferencian de otros organismos incluso del mismo orden. Describir estas diferencias permitiría conocer más detalladamente al parásito aportando datos de utilidad taxonómica y evolutiva y contribuiría al posible desarrollo de tratamientos quimioterapéuticos más específicos y eficientes que los disponibles hasta el presente. Un punto clave en el metabolismo de los tripanosomátidos está asociado a las poliaminas. Estos policationes alifáticos (putrescina, esperrnidina y espermina) están presentes en la mayoría de los organismos, tanto procariotas como eucariotas, cumpliendo funciones celulares esenciales tales como asistir la síntesis de ácidos nucleicos y proteínas, estabilizar macromoléculas y estructuras celulares y participar en la proliferación y diferenciación celular. La biosíntesis de poliaminas comienza por la conversión de ornitina en putrescina por acción de la ornitina decarboxilasa (ODC). Esta enzima es fundamental en la regulación de la síntesis de poliaminas y su actividad esta rigurosamente controlada a distintos niveles. Además, se ha descripto un inhibidor específico e irreversible, difluorometilornitina (DFMO), que ha facilitado el estudio de dicha enzima. Una vía alternativa de síntesis de putrescina actúa a través de la arginina decarboxilasa (ADC) cuyo sustrato es el aminoácido arginina. Esta enzima fue inicialmente descripta en plantas y bacterias y recientemente ha sido encontrada en ciertos tejidos de mamíferos. En parásitos protozoarios existen controversias con respecto a la existencia de las enzimas que catalizan el primer paso de la síntesis de poliaminas, especialmente la ADC. La discutida carencia de dichas actividades es suplida por un transporte activo constitutivo de poliaminas desde el medio extracelular. A lo largo de este trabajo confirmamos que los epimastigotes de distintas cepas de T. cruzi son auxótrofas para poliaminas. Esta auxotrofia esta ocasionada por la falta de la actividad enzimática de ODC y de ADC que, a su vez, se da por la ausencia de los genes correspondientes. Además, se transfectaron epimastigotes de T. cruzi con un vector de expresión recombinado con el gen de ODC de Crithidia fasciculata (clonado en este laboratorio). De este modo, caracterizamos al cultivo transfectado con el gen heterólogo de ODC a nivel fisiológico (capacidad proliferativa), bioquímico (síntesis y concentración intracelular de poliaminas y caracterización de la actividad enzimática heteróloga) y molecular (ubicación del gen heterólogo, determinación del número de copias, etc.). El cultivo transfectado se volvió autótrofo para poliaminas y sensible al inhibidor de la ODC, el DFMO. Sin embargo, luego de un cierto tiempo de cultivo en presencia del inhibidor se seleccionó una subpoblación resistente a DFMO. Este cultivo también fue caracterizado comparándolo con los cultivos sensibles. Finalmente, el parásito transfectado con el gen heterólogo de ODC contribuyó con los estudios sobre el metabolismo de las poliaminas en T. cruzí y podría ser útil en futuras investigaciones acerca de la relación poliaminas - diferenciación a tripomastigote (metaciclogénesis) y poliaminas - infectividad en células de mamíferos.

Abstract:
Trypanosoma cruzi is the etiological agent of “Mal de Chagas”, an endemic illness in Latin America. This unicellular parasite, as other trypanosomatid protozoa, has a complex life cycle involving different hosts (insect vectors - vertebrate hosts). During its life cycle the parasite pass through several differentiation stages undergoing mayor morphological, physiological and biochemical changes in order to adapt to variable environments. Epimastigote is the noninfective form, which proliferates inside the insect and can be easily cultivated in axenic media. Trypanosoma cruzi differs from other trypanosomatid parasites in many physiological and metabolic characteristics. The study of these properties would increase the knowledge of the parasite, providing useful taxonomic and evolutive information. It would also contribute to the development of more specific and efficient chemoterapies against this protozoo. A key point of trypanosome metabolism is related to polyamines. These aliphatic cationes (putrescina, espermidina y espermina) are present in almost all living organisms (prokaryotes as well as eukaryotes). It is well known that polyamines participate in nucleic acids and protein syntheses and can stabilize macromolecules and cellular structures, therefore playing essential roles in cellular proliferation and differentiation. The biosynthesis of polyamines begins with the conversion of ornithine to putrescine by ornithine decarboxylase (ODC). This enzyme is essential in the regulation of the pathway and its activity is tightly controlled at different levels. Difluoromethil-ornitine (DFMO), an specific and irreversible inhibitor of ODC, has been described ago. Arginine decarboxylase (ADC), which catalyses an alternative route to synthesize putrescine from arginine has been first described in plants and bacteria, but recently has also been found in some mammal tissues. The presence of both polyamine biosynthetic pathways (from ornithine and arginine) in some protozoa has been a matter of controversy for many years. In this work, we confirmed that epimastigotes from different wild type strains of T. cruzi are auxotrophic for polyamines. This auxotrophy is due to the absence of ODC and ADC genes in the protozoa genome. These parasites which contain neither ODC nor ADC enzymatic activities are able to obtain polyamines from the environment through an active transport mechanism. We have been able to transform wild type T. cruzi epimastigotes with a recombinant plasmid bearing the ODC gene from Crithidia fasciculata (cloned in a previous work of our laboratory). The resulting transgenic parasites have been studied at the physiological, biochemical and molecular levels in order to determine the relationship among proliferation capacity, intracellular polyamine levels and exogenous gene location and expression. The transfected cultures became autotrophic for polyamine and sensitive to the presence of DFMO. However, after some time of exposure to high levels of the inhibitor, a DFMO resistant subpopulation was naturally selected. This resistant culture has been characterized together with the sensitive counterpart. The transfected parasites containing the heterologous ODC gene is a valuable tool to improve our knowledge about polyamine metabolism in T. cruzi; it could be very useful to study the relationship among differentiation to trypomastigote form (metacyclogenesis), infectivity towards mammalian cells and polyamine endogenous concentrations.

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Registro:
Título : Metabolismo de las poliaminas y su regulación en parásitos tripanosomatidos : expresión del gen de la Ornitina decarboxilasa (ODC) de C. fasciculata en T. cruzi    
Autor : Carrillo, Carolina
Director : Algranati, Israel D.
Año : 2002
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Fundacíon Campomar. Instituto de Investigaciones Bioquímicas (IIB)
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Químicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3472_Carrillo
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Parasitología
Biología / Biología Molecular y Celular
Palabras claves : AMPLIFICACION GENICA; ARGININA DECARBOXILASA (ADC); DIFLUORMETIL ORNITINA (DFMO); EPIMASTIGOTE; LOCALIZACION GENICA; ORNITINA DECARBBOXILASA (ODC); POLIAMINAS (PUTRESCINA,ESPERMIDINA,ESPERMINA); RESISTENCIA A DFMO; TRYPANOSOMA CRUZI (T.CRUZI); ARGININE DECARBOXYLASE (ADC); DFMO- RESISTENCE; DIFLUORMETHYLORNITHINE (DFMO); EPIMASTIGOTE; GENE AMPLIFICATION; GENE ORGANIZATION; ORNITHINE DECARBOXYLASE (ODC); POLYAMINES(PUTRESCINE,SPERMIDINE,SPERMINE); TRYPANOSMA CRUZI(T.CRUZI)
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