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Ver el documento (formato PDF)   Helguero, Luisa Alejandra.  "Expresión y funcionalidad del receptor de progesterona (RP) en la modulación del crecimiento hormono-dependiente y en la adquisición de resistencia al tratamiento hormonal de un modelo murino de carcinogénesis mamaria"  (2002)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
El cáncer de mama es la segunda causa de muerte en las mujeres, luego del cáncer de pulmón. En el desarrollo de esta enfermedad se postulan distintas etapas biológicas que van progresando desde un crecimiento hormono-dependiente a uno hormono-independiente, lo que está asociado a un aumento de la agresividad. En la clínica, si el tumor expresa receptores de estrógenos (RE) y progesterona (RP), una parte importante de los enfoques terapéuticos de elección, es la hormonoterapia con el antiestrógeno tamoxifeno. Sin bien en un principio la gran mayoría de los pacientes responden, con frecuencia el tumor evoluciona hacia la resistencia al tratamiento hormonal, lo que se asocia a diseminación generalizada. Esta resistencia, cuyos mecanismos aun se desconocen, no implica en general una pérdida de expresión de receptores hormonales y todo parece indicar que, o bien existe un cambio intrínseco en éstos, o en los mecanismos que regulan su expresión y activación. En nuestro laboratorio desarrollamos un modelo de adenocarcinomas mamarios murinos por la administración prolongada de MPA en ratones hembras vírgenes de la cepa BALB/c. Estos tumores son en su mayoría de origen ductal con capacidad invasora. En un principio poseen un comportamiento progestágeno-dependiente (PD), requiriendo de la hormona trófica para su crecimiento y expresan RE y RP, pero con el tiempo pueden adquirir un fenotipo progestágeno-independiente, en el cual se conserva aún la expresión de receptores. Previamente hemos demostrado que el RP estaria involucrado en la adquisición de hormonodependencia. El objetivo de este trabajo fue estudiar el papel del RP en la transición de hormono-dependencia a independencia y en la adquisición de resistencia hormonal. Para este estudio utilizamos seis tumores PD y nueve progestágeno-independientes. Caracterizamos la respuesta in vivo de los tumores independientes al tratamiento con los antiprogestágenos onapristona y mifepristona y al 17-β-estradiol. Seis tumores respondieron regresionando, y los llamarnos progestágeno-independientes respondedores (PI-NR) y tres no respondieron; a éstos los denominamos progestágeno-independientes no respondedores (PI-NR). En nuestro laboratorio ya se había evaluado la respuesta in vivo de los tumores PD, y respondieron a estrógenos y antiprogestágenos con regresión. Cuando, en cultivos primarios de un tumor PD, estudiamos la respuesta proliferativa a MPA in vitro observamos que la misma fue bifásica, con dos pendientes estimulatorias, una a concentraciones muy bajas (EC50 = 1.5 ± 0.7 fM) y la otra a concentraciones más altas (EC50 = 0.33 ± 0.3 nM). Con estos resultados, evaluamos por unión del ligando la expresión de receptores en todos los tumores y en tejidos normales. En útero normal, y en tumores PD y PI-R, descubrimos dos sitios receptores de progesterona, uno de alta afinidad no descrito previamente en el RP (Kd = 43 ± 9 pM, Q = 9 ± 2 fmoles/mg de proteína) y el otro sitio clásico que habíamos hallado previamente (Kd= 9.2 ± 4 nM). En los tumores PI-NR no se pudieron determinar estos parámetros. El estudio de la distribución subcelular de RP mostró que en los tumores PD y PI-R se localizan principalmente en el citosol, y son regulados por MPA, mientras que en los tumores PI-NR están principalmente en el núcleo y no son regulados. Sin embargo, durante el ciclo estral, los sitios receptores son regulados en todos los tipos de tumor estudiados. Para caracterizar la expresión de las isoformas del RP utilizamos Western blot. En los tumores PD y PI-R se encontraron ambas isoformas, RPa y RPb, con patrón de expresión similar al de los controles normales, útero y mama de ratón. Encontramos además, una proteína de 78 kDa que se expresa exclusivamente en los tumores, pero no en los tejidos normales. Desconocemos su naturaleza, pero se ha descrito una proteína similar en un 25 % de tumores humanos. Su ausencia de tejidos normales sugiere una posible aplicación como marcador tumoral. Con MPA, ambas isoformas RPA y RPB se regulan negativamente en forma similar. En los tumores PI-R se regula preferencialmente RPb, esto sugeriría un papel del RP en este tipo de crecimiento en particular por RPb. En los tumores PI-NR se detectaron menores niveles de RP, principalmente de RPb. Por estudios de Western Blot se podría predecir la capacidad de los tumores de responder al tratamiento hormonal. Por inmunohistoquímica, no se observaron diferencias en el patrón de marcación entre los tres tipos de tumores. Todos fueron positivos, con un porcentaje de células marcadas del 50 % o más. Los resultados de SSCP indican que la reactividad diferencial de los anticuerpos con Western blot e inmunohistoquímica no se debe a mutaciones en el gen de RP. Hemos teorizado la posibilidad de cambios de expresión de epitopes secundarios al distinto procesado de los tejidos en las técnicas. La caracterización de ARN por protección a RNasa indica que los niveles de RP en tumores PI-R y PI-NR son similares. Es probable que, en los tumores PI-NR, las diferencias de expresión observadas con Western blot se deban a cambios post-traduccionales. Con oligonucleótídos antisentido del RP (asRP) en cultivos primarios de tumores PI-NR demostramos que los RP están involucrados en la proliferación celular aún cuando han perdido la capacidad de unir al antiprogestágeno. Estos resultados, de ser extrapolables al humano indicarían que, en el tratamiento del cáncer de mama resistente a la terapia hormonal aún se podrían utilizar estrategias diseñadas a bloquear la funcionalidad de los receptores hormonales.

Abstract:
Breast cancer is, after lung cancer, the second cause of death in women. The development of this disease occurs through different stages from a hormone-dependent to a hormone-independent growth, which is associated to increased aggressiveness. One of the treatments of choice for ER and PR positive breast cancer is hormone therapy with the antiestrogen tamoxifen. Most of the patients respond, although eventually the tumor becomes refractory and the disease progresses. The mechanisms of resistance remain unknown, but most tumors still express hormone receptors, indicating that there is either an intrinsic modification on these molecules, or in the regulation of their expression and activation. In our laboratory, we have developed a murine mammary adenocarcinoma model by prolonged administration of MPA on female virgin BALB/c mice. Most of these tumors are invasive ductal carcinomas, disclosing a progestin-dependent pattern of growth (PD) and they express ER and PR. Either spontaneously or by successive transplantations in animals not treated with hormones, progestin-independent tumors may arise that maintain the expression of hormone receptors. Our goal was to study the role of PR in the transition from hormone-dependence to independence and in the acquisition of resistance to hormonal therapy. We characterized the in vivo response of progestin-independent tumors to the antiprogestins onapristone and mifepristone and to 17-β-estradiol. Six tumors regressed, and we named them responsive progestin-independent (R-PI); three did not respond and were named unresponsive progestin-independent tumors (UR-PI). We studied the proliferative response to MPA in vitro on primary cultures of a PD tumor, and observed that it was biphasic, with two stimulatory slopes, one at very low concentrations (EC50 = 1.5 ± 0.7 fM), and the other at higher concentrations (EC50 = 0.33 ± 0.3 nM). Based on these results we evaluated the receptor expression by radioligand binding in all the tumors and normal tissues. In uterus, PD and R-PI tumors, we discovered two sites for the progesterone receptor, one of high affinity not previously reported (Kd = 43 ± 9 pM, Q = 9 ± 2 fmoles/mg de protein) and the other site which corresponds to the classical PR described by others (Kd = 9.2 ± 4 nM, Q = 376 ± 74 fmoles/mg de protein). PR, in PD and R-PI tumors, are mainly localized in the cytosol, and are regulated by MPA, while in UR-PI tumors they are mainly in the nucleus and are not regulated by this hormone. Nevertheless, the receptor sites were regulated through the estral cycle in all the tumor types studied. To characterize PR isoform expression we used Western blot. We found both PRa and PRb isoforms in PD and R-PI tumors, with a similar expression pattern compared to the control tissue uterus and normal mammary gland. We also found a 78 kDa protein which is exclusively expressed in tumors but not in normal tissue. Its nature remains unknown but a similar protein has been described in 25 % of human cancers. Its absence in normal tissues suggests a possible use as a tumor marker. With MPA treatment, both PRa and PRb are down regulated. PRb is preferentially down regulated in R-PI tumors and this may be indicating its role in this type of growth. Lower levels of PR were detected in UR-PI tumors, particularly PRb. Based on the Western blot studies the ability of the tumors to respond to hormonal treatment could be predicted. PR expression was also studied by immunohistochemistry. No differences were observed between the staining patterns of the three tumor types. The signal was positive in 50% or more nuclei. We conclude based on the SSCP studies that the differential reactivity between the antibodies used in Western blot and immunohistochemistry is not due to mutations in the PR gene. We theorize the possibility that these changes are product of modifications in the epitope expression due to the processing of the sample for each technique, or to post-translational changes. The studies at RNA level by RNase protection assay indicate that PR expression levels in R-PI and UR-PI tumors are similar. Probably, in UR-PI tumors the lower expression levels observed with Western blot are due to post-translational modifications. In primary cultures of UR-PI tumors, using antisense oligonucleotides to PR (asPR) we demonstrated that PR are involved in cell proliferation even when they have lost their ability to bind to the antiprogestagens. The importance of these observations relies in that, if these results to humans are possible to extrapolate to human, in the treatment of hormone resistant breast cancer strategies designed to block the functionality of these receptors could still be used.

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Registro:
Título : Expresión y funcionalidad del receptor de progesterona (RP) en la modulación del crecimiento hormono-dependiente y en la adquisición de resistencia al tratamiento hormonal de un modelo murino de carcinogénesis mamaria     =    Progesterone receptor (RP) expression and functionality in the modulation of hormone-dependent growth and in the acquisition of resistance to hormonal treatment in a model of murine mammary carcinogenesis
Autor : Helguero, Luisa Alejandra
Director : Molinolo, Alfredo A.
Año : 2002
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Instituto de Biologia y Medicina Experimental (IByME). Laboratorio de Carcinogénesis Hormonal
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3495_Helguero
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Biomedicina
Biología / Endocrinología
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