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Ver el documento (formato PDF)   Guberman, Alejandra Sonia.  "Represión de la expresión génica mediante el secuestro de un coactivador : Transducción de la señal y elementos involucrados en la regulación ejercida por ésteres de forbol sobre el promotor del gen 5-aminolevulinato sintetasa"  (2002)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
Los factores de transcripción AP-1 (Activation protein-1) son genes tempranos involucrados en gran diversidad de procesos regulatorios. El éster de forbol 12-O-tetradecanoilforbol- l3-acetato (TPA) es utilizado habitualmente para inducir la actividad de AP-1 y proteinquinasa C (PKC). El propósito de este trabajo es explorar los mecanismos moleculares involucrados en la regulación por TPA de la expresión del gen de 5-aminolevulinato sintetasa (ALAS), la primer enzima y determinante de velocidad de la biosíntesis de hemo. Análisis previos de la secuencia 5’ flanqueante revelaron la existencia de dos elementos de respuesta a cAMP (CRE) requeridos para la expresión basal y estimulada por CAMP. El fragmento —833a +42 en la región 5’flanqueante del gen de ALAS de rata, fue subclonado en un vector con el gen reporter cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). El vector de expresión, pALAS/CAT, produjo una significativa actividad CAT en células de hepatoma humano HepG2 transfectadas transientemente, que fue reprimida por TPA. Mediante análisis de secuencias y deleciones dctectamos un elemento de respuesta a TPA (TRE), localizado entre —261 y -255 que según establecimos por mutagénesis, es crítico para la regulación por TPA. Demostramos que c-Fos, c-Jun y JunD están involucrados en el efecto inhibitorio por su habilidad de interactuar con TRE-ALAS, como evidenciamos por análisis de supershift y su capacidad para reprimir la actividad del promotor en ensayos de transfección. Demostramos la participación de componentes de diferentes vías de señalización. Se encuentran involucradas la isoforma α de la PKC, la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K), la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK 1/2) y la quinasa N-terminal de c-Jun (JNK). Asimismo, presentarnos a la quinasa p90RSK2 como un posible punto de convergencia de las vías de PI3K y ERK. Mediante sobreexpresión de CBP (CRE protein binding protein) o p300, se bloqueó significativamente la represión por TPA o sobreexpresión de Fos/Jun, de la actividad del promotor de ALAS. Por otra parte, cuando el sitio TRE se ubicó en diferente contexto con respecto a los sitios CRE, éste se comportó como un enhancer de la transcripción. Proponemos que la disminución en la actividad basal del promotor de ALAS en presencia del TPA puede reflejar una disminución en la capacidad del promotor de ensamblar un complejo de pre-iniciación eficiente, debido al secuestro de CBP, por parte de AP-1. Asimismo, sugerimos que las propiedades transcripcionales del sitio TRE serian dependientes de la disposición espacial, con respecto a los sitios CRE.

Abstract:
Activation protein -1 (AP-1) transcription factors are early response genes involved in a diverse set of transcriptional regulatory processes. The phorbol ester 12-O-tetradecanoylphorbol- l3-acetate (TPA) is often used to induce AP-1 and PKC activity. The purpose of this work is to explore the molecular mechanisms involved in the TPA regulation of 5-aminolevulinate synthase (ALAS) gene expression, the first and rate-controlling step of the heme biosynthesis. Previous analyses of the 5’-flanking sequence of ALAS revealed the existence of two camp response elements (CRE) required for basal and cAMP-stimulated expression. The fragment —833 to +42 in the 5’-flanking region of rat ALAS gene, was subcloned into a chloramphenicol acetyltransferase (CAT) reporter vector. The expression vector, pALAS/CAT, produced a significant CAT activity in transiently transfected HepG2 human hepatoma cells, which was repressed by TPA. Sequence and deletion analyses detected a TPA response element (TRE), located between —261 and —255 (TRE-ALAS), critical for TPA regulation, as we established by mutagenesis. We demonstrated that c-Fos, c-Jun, and JunD are involved in TPA inhibitory effect due to their ability to bind TRE-ALAS evidenced by supershift analyses and their capacity to repress promoter activity in transfection assays. We demonstrated the participation of components of different signaling pathways. The α isoform of proteinkinase C (α PKC), phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), extracellular signal regulated kinase (ERK 1/2) and c-Jun N-terminal kinase (JNK) are involved. The p90RSK2 is presented as a putative convergence point of the P13K and ERK pathways. Repression of ALAS promoter activity by TPA-treatment or Fos/Jun overexpression was largely relieved when CRE protein binding protein (CBP) or p300 was ectopically expressed. When the TRE site was placed in a different context with respect to CRE sites, it appeared to act as a transcriptional enhancer. We propose that the decrease in ALAS basal activity observed in the presence of TPA may reflect a lower ability of this promoter to assemble the productive pre-initiation complex due to CBP sequestration. We also suggest that the transcriptional properties of this AP-1 site would depend of a spatial-disposition-dependent manner with respect to the CRE sites.

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Registro:
Título : Represión de la expresión génica mediante el secuestro de un coactivador : Transducción de la señal y elementos involucrados en la regulación ejercida por ésteres de forbol sobre el promotor del gen 5-aminolevulinato sintetasa    
Autor : Guberman, Alejandra Sonia
Director : Cánepa, Eduardo Tomás
Año : 2002
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Química Biológica. Laboratorio de Biología Molecular
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Químicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3496_Guberman
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Biología Molecular y Celular
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