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Ver el documento (formato PDF)   Furlong, Laura Inés.  "Caracterización bioquímica y molecular de los sitios de unión a zona pellucida presentes en proacrosina humana"  (2002)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
El presente trabajo tuvo como objetivo estudiar el rol de la proteina espermática humana proacrosina/acrosina como molécula de adhesión a las glicoproteínas de la zona pellucída (ZP). En una primera etapa, se llevó a cabo un análisis bioinformático sobre la secuencia aminoacídica de proacrosina con el propósito de identificar sitios potenciales de unión a glicoproteínas de la ZP. El resultado de este análisis reveló que los residuos Lys74. Lys169, Arg172, Arg199, Arg249, Lys251, Arg252 y la secuencia KRLQQKLIE, localizada entre los residuos 367-374, conformarían sitios potenciales de unión a la ZP. A continuación se realizaron experimentos para evaluar la interacción entre proacrosina/acrosina con glicoproteínas de la ZP. Para ello se desarrolló una estrategia de subclonado del ADNc de proacrosina humana en vectores de expresión procariotas (pET-22b, pGEX-3X) para la expresión de proacrosina recombinante. Utilizando el sistema de expresión en forma directa (pET-22b) se obtuvo un producto de expresión recombinante correspondiente a la proenzima (Rec-40), y productos truncados del extremo N-terminal de la proteína (Rec-30, Rec-20, Rec-10). Estas proteinas fueron caracterizadas mediante la utilización de anticuerpos especificos y análisis de secuenciación de aminoácidos, determinándose que Rec-30 correspondería a los residuos 1-300, Rec-20 a 1-190 y Rec-10 a 1-160 de proacrosina humana. Utilizando el mismo sistema de expresión se sintetizó un producto de expresión correspondiente a los residuos 1-59 de proacrosina (Rec-6). Los productos de expresión, obtenidos como cuerpos de inclusión, fueron solubilizados y aislados mediante electroforesis preparativa. El estudio de la interacción entre proacrosina/acrosina recombinante y las glicoproteínas de la ZP se llevó a cabo utilizando ensayos de unión en fase sólida ("Ligand blot", "Dot blot", ensayo en placa de poliestireno). Se utilizaron glicoproteínas obtenidas de ovocitos humanos de descarte de programas de fecundación in vitro, así como glicoproteínas obtenidas por expresión en células CHO a partir del ADNc (rec-hZPA, rec-hZPB, rec-hZPC). El resultado de estos estudios indicó que proacrosina recombinante (Rec-40) y fragmentos del extremo N-terminal de la proteína (Rec-30, 20 y 10) tienen capacidad de unión a glicoproteínas de la ZP y a azúcares. Las glicoproteínas de la ZP mostraron diferente capacidad de unión a proacrosina/acrosina, siendo hZPA el ligando principal. El mecanismo de unión involucraría interacciones electrostáticas entre aminoácidos cargados positivamente en proacrosina/acrosina, y oligosacáridos sulfatados en la ZP, así como el reconocimiento de residuos de fucosa y manosa presentes en los oligosacáridos de la ZP. El resultado del mapeo de los sitios de unión en la molécula de proacrosina permite proponer que éstos estarían localizados en dos regiones de la proteína. Una región estaría comprendida entre los residuos 59-160 (Dominio II), y otra entre los residuos 300-402 (Dominio III). Los sitios de unión localizados en el Dominio II de la proteina estarían estabilizados por uniones no covalentes y puentes disulfuro, mientras que los sitios localizados en el Domino II estarían estabilizados por interacciones no covalentes, y tendrían una contribución principal a la afinidad de la interacción. En dichas regiones, los residuos Lys74, Lys108, Lys114 y el motivo KRLQQKLIE (residuos 367-374), identificados mediante el análisis de secuencias, participarían en la interacción con glicoproteinas de la ZP y azúcares. En resumen, este trabajo muestra que proacrosina/acrosina humana presenta La capacidad de reconocer glicoproteinas de la ZP. de manera independiente de la actividad de proteasa. Esto permite proponer que proacrosina/acrosina participaría como molécula de adhesión en la unión secundaria del espermatozoide a la ZP en el humano.

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Registro:
Título : Caracterización bioquímica y molecular de los sitios de unión a zona pellucida presentes en proacrosina humana    
Autor : Furlong, Laura Inés
Director : Vazquez-Levin, Mónica H.
Año : 2002
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Instituto de Biología y Medicina Experimental (IByME)
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3514_Furlong
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Biología Molecular y Celular
Palabras claves : FECUNDACION; ESPERMATOZOIDE; OVOCITO; ACROSOMA; ZONA PELLUCIDA; ACROSINA; 
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