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Ver el documento (formato PDF)   Ghio, Sergio Claudio.  "Clonado y caracterización de un antígeno rico en aminoacidos ácidos de Trypanosoma cruzi y su posible rol en la inmunopatogenia de la cardiopatía chagásica crónica"  (2003)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
Se ha postulado la hipótesis de un origen autoinmune para explicar la etiología de la enfermedad de Chagas. Este proceso autoinmune podría ser el resultado de una respuesta inmune cruzada contra componentes específicos de células cardíacas que comparten epítopes con antígenos de Trypanosoma cruzí (mimetismo molecular). En trabajos anteriores demostramos que los anticuerpos de pacientes crónicos, inmunopurificados con el péptido correspondiente a los 13 aa C-terminales de la proteína ribosomal P28 de T. cruzi (TcP2β),alteraron la frecuencia de latidos de cardiocitos en cultivo ya que también podían reconocer el segundo bucle de los receptores cardiacos (M2 muscarínicos y β-adrenérgícos). Lo mismo ocurrió con los inmunopurificados contra un péptido correspondiente a la proteína ribosomal P0 (TcP0). Tanto los epítopes parasitarios como los del hospedador reconocidos por estos anticuerpos estaban formados por secuencias aminoacídicas ácidas. En la búsqueda de nuevos antígenos que pudieran producir este tipo de reacción cruzada, se propuso el rastreo de ESTs (Expressed Sequence Tags) producidos en el Proyecto Genoma T. cruzi que codificaran para proteínas ricas en secuencias ácidas. De este modo se aisló un EST de 718 pb. Se obtuvo la secuencia completa del gen que denominamos garp (glutamic acid rich protein) de 3500 pb, que es de copia única y origina un único ARNm de aproximadamente 4 kb. Según la comparación de secuencias se encontró una identidad de hasta 72% con secuencias de T. brucei. La proteína es de 130 KDa, y según ensayos de Western blot e inmunofluorescencia se localiza en el citoplasma del parásito. Aproximadamente el 20% de los sueros de pacientes con la enfermedad de Chagas crónica fueron capaces de reconocer la proteína recombinante GARP, y todos ellos lo hicieron con la región más C-terminal de la proteína, que contiene los aminoácidos ácidos. La inmunización con la proteína recombínante GARP provocó la aparición de anticuerpos dirigidos contra toda la proteína. Estos anticuerpos no modificaron la frecuencia de latidos de los cardiocítos en cultivo, y consecuentemente los ratones no sufrieron alteraciones electrocardiográficas. Como un método alternativo de inmunización, ensayamos la metodologia de inmunización con ADN. Con esta técnica de inmunización se pretendía reflejar mejor la situación de la infección crónica, ya que la presentación constantes de los antígenos parasitarios por las células musculares del hospedador podría ser mas adecuada para estudiar la patogenicidad de la enfermedad. Para poner a punto esta metodología, realizamos inmunizaciones con las proteínas ribosomales TcP2β y TcP0. Las inmunizaciones de ADN con TcP2β ,TcP0 y GARP generaron anticuerpos capaces de reconocer epítopes diferentes a los reconocidos en la infección natural. Los anticuerpos no provocaron alteraciones en la frecuencia de latidos de cardiocitos en cultivo ni se observaron alteraciones electrocardiográficas tales como las ocurridas cuando ratones fueron inmunizados con proteínas recombinantes TcP2β y TcP0. Por tanto concluimos que la inmunización con ADN es capaz de generar anticuerpos que reconocen epítopes diferentes a los inducidos por inmunizaciones con proteínas recombinantes o por la infección natural, lo cual es de utilidad al momento de generar una vacuna contra T. cruzi.

Abstract:
The hypothesis of an autoimmune origin has been postulated to explain the etiology of the Chagas' heart disease. This autoimmune process could be the result of an immune response capable of cross-reacting to specific components of heart (issues that share epitopes with antigens of Trypanosoma cruzi (molecular mimicry). As we have previously reported, antibodies of chronic patients, recognizing a peptide corresponding to the 13 aminoacid C-terminus (peptide R13) of the T. cruzi ribosomal P2 β protein (TcP2β) altered the frequency of cardiomyocyte beating culture. This antibodies were also able to recognize the second extracellular loop of the G-protein coupled receptors (M2 muscarinic and β-adrenergic receptors). Antibodies immunopurified against the C-terminus of the T. cruzi ribosomal P0 protein (TcP0) present a similar functional and physicochemical features. Both the parasitic and the host epitopes recognized by these antibodies are composed of acidic sequences. In the search of new antigens that could produce this type of cross-reaction, we looked for ESTs (Expressed Sequence Tags) in the Genome Project of T. cruzi coding for acidic residues rich proteins. So we identified a EST of 718 bp. The complete sequence of the gene (3500 bp) was obtained and we named it garp (glutamic acid rich protein). This gene exists in a single copy and gives origin to only transcript of approximately 4 kb. Its sequence was compared with database, finding a identity up to 72% with T. brucei sequences. The protein has 130 KDa, and both Western blot and immunofluorescence assays located it into cytoplasm. Approximately 20% of the sera of chronic chagasic patients were capable to recognize the recombinant protein GARP, and all of them recognized only the C-terminus of GARP, which contains the acidic sequences. When we immunized mice with the recombinant protein GARP, we achieved antibodies against the whole protein GARP. With anti-GARP serum we carried out assays on beating rat cardiomyocytes. With neither of the antisera beating frequency was altered and immunized mice with high anti-GARP titers showed no electrocardiografic alterations. As alternative method of immunization, we assayed immunizations with DNA plasmids. With this immunization technique we attempted to reflect better the situation of the chronic infection, since the constant presentation of the parasitic antigens from the host’s muscular cells could be more appropriate to study the pathogenicity of the disease. To set up this methodology we achieved immunizations with DNA coding genes of ribosomal TcP2β and TcP0 proteins. The DNA immunizations with TcP2β, TcP0 and GARP generated antibodies capable to recognize different epitopes to those obtained in the natural infection. No alterations in cardyocytes culture nor electrocardiografics recording in mice were observed. In contrast, immunization with TcP2β and TcP0 recombinant proteins generated functionally active antibodies. So we conclude that DNA immunization is useful to generate antibodies against epitopes that are different than the antibodies obtained in immunization with recombinant protein o in the natural infection. This could be useful to generate a vaccine against T. cruzi.

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Registro:
Título : Clonado y caracterización de un antígeno rico en aminoacidos ácidos de Trypanosoma cruzi y su posible rol en la inmunopatogenia de la cardiopatía chagásica crónica     =    Cloning and characterization of an acid aminoacid rich antigen of Trypanosoma cruzi and its role posible in the immunopathogeny of the chronic Chagas’ heart disease
Autor : Ghio, Sergio Claudio
Director : Levin, Mariano
Director Asistente : Levitus, Gabriela
Año : 2003
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular (INGEBI). Laboratorio de Biología Molecular de la Enfermedad de Chagas
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3535_Ghio
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Parasitología
Biología / Inmunología
Biología / Biología Molecular y Celular
Palabras claves : GARP (GLUTAMIC ACID RICH PROTEIN); TRYPANOSOMA CRUZI; INMUNIZACION CON ADN; PROTEINAS RIBOSOMALES P; GARP (GLUTAMIC ACID RICH PROTEIN); TRYPANOSOMA CRUZI; DNA INMUNIZATION; RIBOSOMAL P PROTEINS
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