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Ver el documento (formato PDF)   Otero, Marcelo Javier.  "Construcción y caracterización de estructuras complejas de biomoléculas con aplicación en el diseño de biosensores"  (2003)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
Un biosensor es un dispositivo de reconocimiento molecular donde una biomolécula interactúa en forma altamente específica con un analito y donde el cambio químico producido en presencia del analito se traduce en una señal eléctrica procesable. Una de las etapas más importantes en el diseño de un biosensor es la de generar una estructura o superestructura, en la cual estén insertas las biomoléculas responsables de la respuesta del sensor. De esta etapa dependerán la actividad de la biomolécula, la sensibilidad, la especificidad y el ámbito de uso del biosensor. En este trabajo de tesis se estudiaron diversos aspectos de la inmovilización de enzimas y anticuerpos en el contexto de la construcción de electrodos enzimáticos para la detección de glucosa y de la construcción de sensores inmunológicos para detectar moléculas pequeñas a través de un ensayo competitivo. Para ello se utilizaron en forma complementaria distintas técnicas como la Microbalanza de Cristal de Cuarzo (QCM), la Elipsometría, la Microscopía de Fuerza Atómica (AFM)y diversas Técnicas Electroquímicas. Como técnicas de inmovilización se utilizaron la funcionalización covalente de superficies, el autoensamblado electrostático, el empleo de uniones de importancia biológica como avidina-biotina o antígeno-anticuerpo en la inmovilización de enzimas y el uso de proteínas orientadoras como proteína A y proteína G para la inmovilización de anticuerpos. En primer lugar se describe el uso de la microbalanza de cristal de cuarzo para estudiar sistemas autoensamblados en multicapas de glucosa oxidasa (GOx)y polialilamina derivatizada covalentemente con un complejo de Os: +, (PAH-Os), depositadas sobre superficies de oro modificadas con ácido 3-mercaptopropansulfónico (MPS). Las etapas de adsorción del polímero y la glucosa oxidasa se repitieron alternadamente obteniendo cristales de cuarzo modificados hasta con 14 bicapas de polímero-enzima. El espesor elipsométrico, determinado a tres longitudes de onda, y la masa de las películas autoensambladas, determinadas por QCM en condiciones gravimétricas, se determinaron en contacto con solución de electrolito y en condiciones de sequedad y se estimó a partir de dichas mediciones la densidad de la película en ambas condiciones. Se plantea en esta tesis una estrategia general para la extracción de las propiedades viscoelásticas de peliculas autoensambladas por combinación de QCM y elipsometría. Por combinación del espesor y densidad estimados de la película, la expresión de la impedancia mecánica superficial del cristal de cuarzo, y la viscosidad y densidad del electrolito, se pudieron estimar los valores de los módulos de almacenamiento (G') y perdida (G") a 10 MHz para una película autoensamblada como función del espesor y el potencial de electrodo durante dos tipos de perturbaciones electroquímicas: voltametría cíclica y saltos de potencial. Una vez planteada la utilidad de ambas técnicas, QCM y elipsometría en el estudio de la construcción de películas autoensambladas, éstas se emplearon para el estudio del crecimiento de películas autoensambladas de glucosa oxidasa biotinizada y PAH-Os utilizando dos estrategias distintas de inmovilización de la enzima: la formación de una unión antígeno-anticuerpo y la formación de una unión avidina-biotina. Se estudió la cinética de adsorción de las biomoléculas y el grado de inespecificidad de las interacciones durante la inmovilización de la enzima. Se estudió además el comportamiento biocatalítico de la glucosa oxidasa biotinizada inmovilizada en las distintas estructuras autoensambladas y se llegó a la conclusión de que la eficiencia de la comunicación eléctrica entre las enzimas y el mediador se ve afectada tanto por el tipo de inmovilización de la enzima, como por la cantidad de centros redox del polímero de osmio por cada molécula de enzima. Las enzimas redox inmovilizadas en estructuras autoensambladas no solamente tienen aplicación en el diseño de electrodos enzimáticos, sino también en el desarrollo de biosensores inmunológicos. La formación de una unión antígeno-anticuerpo no genera una señal medible por lo cual se recurre al uso de sustancias marcadoras. La mayor parte de los inmunoelectrodos desarrollados últimamente están basados en el uso de enzimas oxidoreductasas como marcadoras. Además de los marcadores es necesario utilizar mediadores redox para transferir la carga entre el electrodo y el sitio redox de la enzima y revelar la actividad enzimática a través de la señal del mediador. De este modo la superficie del electrodo representa, tanto el transductor para la detección enzimática, como el soporte inerte sobre el cual se inmovilizan los antígenos o los anticuerpos. En este contexto se construyeron multicapas autoensambladas de PAH-Os y un anticuerpo, IgG antibiotina, con el objetivo de construir un biosensor modelo para la detección de moléculas pequeñas (como la biotina) a través de un ensayo competitivo, utilizando un marcador enzimático basado en peroxidasa de rábano, HRP-biotina. Con la técnica de EQCM se estudió la deposición de las multicapas, es decir la cantidad de IgG depositada en cada capa, los cambios viscoelásticos durante la adsorción, la cinética de adsorción para distintas concentraciones de IgG y el pegado del marcador o conjugado HRP-biotina. Con la técnica de AFM se observó la estructura y orientación de las moléculas de IgG adsorbidas sobre el polímero y finalmente con las técnicas electroquímicas se estudió el crecimiento de las bicapas y la utilidad de la supraestructura como biosensor, a través del estudio de la catálisis enzimática del conjugado. Finalmente se describen resultados preliminares sobre el uso de proteínas orientadoras, proteína A y G’, utilizadas para disminuir la inespecificidad del sensor y favorecer la reacción entre el antígeno y el anticuerpo inmovilizado. En conclusión, los resultados obtenidos confirman que la inmovilización de biomoléculas es por cierto una de las etapas más importantes en el desarrollo de un biosensor al afectar la respuesta del mismo. Además se muestra la necesidad de recurrir a distintas técnicas para su estudio y de este modo contrarrestar las limitaciones propias de cada técnica.

Abstract:
A biosensor is a molecular recognition device, in which a biomolecule interacts high specifically with an analyte and where the chemical change produced by its presence is transduced into a processable electric signal. One of the most important stages of biosensor design is the generation of a structure or superstructure that contains the biomolecules responsible of the sensor response. The biomolecule activity, the sensibility, the specificity and the use of the biosensor depend on this stage. ln this thesis were studied different aspects of the enzymes and antibodies immobilization in the context of the development of enzymatic electrodes for glucose detection and the construction of immunosensors for the detection of small molecules through a competitive assay. For this purpose several complementary techniques were used such as Quartz Crystal Microbalance (QCM), Ellipsometry, Atomic Force Microscopy (AFM) and electrochemical techniques. Different types of immobilization were used namely electrostatic self-assembly, covalent functionalization of surfaces, the use of biological unions like avidin-biotin or antigen-antibody for the immobilization of enzymes and the use of binding proteins like protein A and protein G for the immobilization of antibodies. First of all have been described the used of the Quartz Crystal Microbalance for the study of layer by layer self assembled multilayers of glucose oxidase (GOx) and a redox polymer polyallylamine-Os(bpy)2ClPyCH2NH (PAH-Os), deposited on to thiol modified gold surfaces. The alternate adsorption steps of the polymer and the enzyme were repeated, reaching up to 14 polymer-enzyme bilayers. The ellipsometric thickness and the QCM gravimetric response were determined for the self-assembly films under electrolyte solution and in air. The density of the films was estimated in both environmental conditions. In this thesis a general strategy for the determination of the viscoelastic properties of self-assembled multilayers with the combination of QCM and ellipsometry has been suggested. By combininig the estimated film thickness and density, the expression of the electrical impedance of the modified quartz crystal surface and the properties of the solution, it was possible to estimate the storage (G’) and loss gear (G”) moduli at 10 MHz for a self-assembled film as a function of the thickness and electrode potential under two different electrochemical perturbations: Cyclic Voltammetry and Potential Steps. Once the combination of both techniques proved to be useful in the study of film construction, they were used to study the growth of self-assembled monolayers of biotinylated glucose oxidase and PAH-Os by using two different approaches of enzyme immobilization: the antigen-antibody binding and the avidin-biotin binding. The adsorption kinetics, the specificity of the interactions, and the biocatalytical behaviour of the immobilized enzyme in the different strategies were studied. It was concluded that not only is the electrical wiring efficiency between the enzyme and the mediator affected by the immobilization strategy, but also by the relationship between the concentration of redox centers and the concentration of enzyme. It is currently widely known that the immobilized redox enzymes in self-assembled structures can be applied in the design of enzymatic electrodes, but also in the development of immunological biosensors. The binding between an antigen and the specific antibody does not generate a measurable signal, and therefore a marker must be used. Many of the recently developed immunoelectrodes use an oxidoreductase enzyme marker. Apart from the marker, it is also necessary to use a redox mediator in order to transfer the redox charge between the electrode and the redox sites and to detect the enzyme activity through the mediator signal. The electrode surface has two different functions: as inert substrate for the antibodies and as enzymatic detection transducer. Self assembled multilayers of PAH-Os and an antibody, IgG antibiotin, were constructed in order to develop a biosensor for the detection of small molecules such as biotin through a competitive assay, using an enzymatic marker or conjugate: horseradish peroxidase-biotin (HRP-biotin). By use of the QCM technique it was possible to investigate the adsorption of IgG in the multilayers, the viscoelastic changes during the protein uptake, the adsorption kinetics for different antibody concentrations and the conjugate adsorption. The structure and orientation of the IgG molecules on the polymer modified surface were studied with AFM. And finally the growth of the layers and the utility of the superstructure as biosensor were studied with electrochemical techniques. Preliminary results of the use of binding proteins like protein A and protein G’, used in order to improve the immunological reaction, were also described. In conclusion, the obtained results confirm that the biomolecule immobilization is one of the most critical stages in the development of a biosensor, since it affects the biosensor use and response. It has also been shown the need for the use of different complementary techniques in order to characterize the construction of self-assembled multilayers.

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Registro:
Título : Construcción y caracterización de estructuras complejas de biomoléculas con aplicación en el diseño de biosensores     =    Construction and characterization of complex biomolecules structures with application in biosensors design
Autor : Otero, Marcelo Javier
Director : Calvo, Ernesto Julio
Año : 2003
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física
Instituto de Química Física de los Materiales, Medio Ambiente y Energía (INQUIMAE)
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Químicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3562_Otero
Idioma : Español
Area Temática : Química / Química Analítica
Química / Electroquímica
Palabras claves : PELICULAS AUTOENSAMBLADAS; ELECTRODOS ENZIMATICOS E INMUNOLOGICOS; MICROBALANZA DE CRISTAL DE CUARZO; PROPIEDADES VISCOELASTICAS; AVIDINA-BIOTINA; ANTIGENO-ANTICUERPO; SELF-ASSEMBLED MULTILAYERS; ENZYMATIC AND IMMUNOLOGICAL ELECTRODES; QUARTZ CRYSTAL MICROBALANCE; VISCOELASTIC PROPIERTIES; AVIDIN-BIOTIN; ANTIGEN-ANTIBODY
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