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Ver el documento (formato PDF)   Alemán, Mercedes.  "Papel de los polimorfonucleares neutrófilos en el proceso inflamatorio crónico de la tuberculosis : efecto del Mycobacterium tuberculosis y mecanismos involucrados"  (2003)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
La tuberculosis (TB) es una enfermedad inflamatoria crónica causada por Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Al comienzo de una infección por micobacterias, la activación de las células de la inmunidad innata (linfocitos Natural Killer (NK), Tγδ y polimorfonucleares neutrófilos (PMN), asi como las citoquinas (CK) secretadas por ellas, influencian y modulan el curso de la reacción inflamatoria. Los PMN participan en la formación del granuloma, precediendo a los monocitos en las áreas de inflamación granulomatosa, liberando quimioquinas (QK) que atraen a los monocitos activándolos indirectamente. A pesar de que, durante el curso crónico de la TB humana, la respuesta inflamatoria se caracteriza por un infiltradode monocitos-macrófagos en el sitio de infección pulmonar, a medida que la enfermedad avanza se puede observar un elevado número de PMN en el lavado broncoalveolar (BAL)que se correlaciona con el contenido de interleuquina (IL)-8 en pulmón. Esta CK, cuya producción por el macrófago es inducida por interleuquina (IL)-1β y factor de necrosis tumoral (TNF)-α, podria inducir a su vez la secreción de otras CK por el PMN. Por otra parte, se ha demostrado que, dentro de las lesiones pulmonares, los PMN son capaces de matar a la micobacteria. Luego de arribar al foco inflamatorio, los PMN subyacen a la muerte. Esto puede ocurrir por dos mecanismos de muerte: 1) necrosis: donde la liberación del contenido citoplasmático al medio extracelular provoca una respuesta de tipo inflamatoria, 2) apoptosis: donde la membrana permanece intacta, de manera que los neutrófilos son removidos por los macrófagos sin liberar su contenido. Además, cuando los macrófagos ingieren células apoptóticas, no liberan mediadores pro-inflamatorios pero si en cambio moléculas de acción anti-inflamatorias. Por otra parte, los PMN apoptóticos pierden previamente la habilidad de degranulación, fagocitosis, estallido respiratorio y quimiotaxis. Por eso, si bien los PMN juegan un rol central en la defensa contra microorganismos infecciosos, la presencia de estas células en el pulmón puede contribuir a la injuria tisular local y en este contexto, la muerte del PMN por apoptosis, representa un mecanismo que permite su reconocimiento e ingestión por los macrófagos residentes, limitando asi el daño tisular que genera el marcado influjo de PMN durante el curso de una infección bacteriana. El objetivo de este trabajo fue estudiar el estado de activación de los PMN circulantes en pacientes con TB (TB-PMN) y su posible contribución a la fisiopatología de esta enfermedad. Por otra parte, sabiendo que muchas funciones que dependen de la activación del PMN generan en éste señales intracelulares, que estarían asociadas a la inducción del proceso apoptótico en los PMN, estudiamos la apoptosis en los PMN circulantes y el proceso apoptótico espontáneo e inducido por Mtb in vitro evaluando a su vez los mecanismos involucrados en este fenómeno y las señales intracelulares que participan. Por último, para corroborar los experimentos in vitro, evaluamos los mismos parámetros en líquidos pleurales de pacientes con TB y patologías no relacionadas. Los resultados demuestran que: ▪ Los polimorfonucleares neutrófilos circulantes de pacientes con TB (TB-PMN), tienen aumentada la expresión del receptor para la fracción constante de la inmunoglobulina G (FcγR)-IIIB(CD16) y el receptor para TNFα de 55 kD (TNF-R55). A su vez se observó la expresión del FCγRI (CDG4)que no se expresa constitutivamente en PMN. En concordancia con el aumento en la expresión de los receptores CD16 y CD64, las funciones que de ellos dependen tales como citotoxicidad mediada por complejos inmunes (Cx-CI) y citotoxicidad dependiente de anticuerpos (CCDA), también se hallaron aumentadas en los TB-PMN. ▪ Por otra parte, en los TB-PMN la liberación de anión superóxido fue inducida a concentraciones quimioatractantes del péptido formilado FMLP. Estos resultados sugieren que los PMN de los pacientes con TB se encuentran activados y liberando intermediarios reactivos del oxigeno, fuera del sitio de infección. Por lo tanto la activación de los PMN en sangre periférica observada en los pacientes, puede ser considerada como una inflamación sistémica, contribuyendo a la fisiopatología del proceso crónico inflamatorio en tuberculosis. ▪ En circulación los PMN de los pacientes con TB no presentan signos de apoptosis. Los TB-PMN tienen mayor expresión de los receptores CD16 y CD11b, ambos son parámetros indicativos de la activación del PMN. ▪ Los TB-PMN presentan una apoptosis espontánea aumentada que se correlaciona con la pérdida espontánea del receptor CD16 en cultivo (marcador de apoptosis en PMN). La marcada apoptosis espontánea podria explicarse por la mayor expresión en membrana de la proteína pro-apoptótica Fas y una menor expresión de la proteina anti-apoptótica bcl-2 en citoplasma. ▪ Mtb activa a los PMN in vitro incrementando la expresión de CD11b tanto en N- como en TB-PMN y dicha activación aceleraría el proceso apoptótico in vitro. Más aún, observamos que los PMN activados se ubican en una zona de mayor tamaño celular y mayor expresión de CD11b. Este hecho, nos permite postular que la mayor apoptosis espontánea observada en los TB-PMN, podría deberse al estado de activación que in vivo presentan los PMN de pacientes con TB. ▪ La apoptosis inducida por Mtb en los TB-PMN está inicialmente retrasada. Este hecho se correlacionó con la conservación del receptor CD16 y una mayor producción de IL-8. A períodos mas prolongados, Mtb aceleró significativamente la apoptosis en los pacientes. ▪ El componente del Mtb causante del efecto apoptótico, no seria manLAM ni estaría presente en el el lisado total bacteriano de la cepa virulenta Rv utilizada en este trabajo, ya que no indujeron apoptosis comparable con la bacteria entera. El efecto pro-apoptótico del Mtb ocurre aún a relaciones no fagocíticas (Mtb:PMN, 1:3). Por lo tanto, el Mtb entero dispararía el proceso apoptótico sin necesidad de ser fagocitado. ▪ La apoptosis no está mediada por el TNFα endógeno y no involucra al receptor CD11b. ▪ La apoptosis inducida por Mtb en TB-PMN es dosis dependiente. A pesar de que la fagocitosis de la bacteria induce el proceso apoptótico en PMN, nosotros mostramos que la apoptosis es inducida también a bajas relaciones Mtb:PMN(1:3). Por Io tanto, La apoptosis inducida por Mtb ocurriría mediante la interacción de la bacteria con un receptor diferente del CD11b sin mediar fagocitosis. ▪ Analizamos la activación de ciertas kinasas tales como mitogen-activated-protein-kinasa (MAPK)p38 que en los PMN estaría asociada tanto a la activación celular como al proceso apoptótico y extracelullar-signal-regulated kinase (ERK) ERK1/2 asociada a la sobrevida. Observamos que p38 MAPK participa en la apoptosis mediada por Mtb, pero no en la apoptosis espontánea. Por otro lado, la activación de ERK sería necesaria para prevenir el proceso apoptótico ya que al inhibirla se indujo un aumento en la apoptosis. Esto hecho, podría deberse a la anulación de alguna señal anti-apoptótica que actúa por esta vía, como por ejemplo la IL-8. ▪ La expresión de Ia MAPK p38 fosforilada (activada) se encontró elevada en los TB-PMN circulantes respecto de PMN de individuos sanos o de patologías inflamatorias no relacionadas. Además, Mtb es capaz de inducir la expresión de p-p38 MAPK. ▪ Finalmente, evaluamos los parámetros de activación y apoptosis de los PMN en líquidos plurales. Observamos que los PMN presentes en líquidos pleurales de pacientes con tuberculosis, presentan un aumento en la expresión de los marcadores de activación, CD64, CD11b, TNF-R55 y una disminución del CD16, respecto de sangre periférica del mismo paciente. Basados en los experimentos in vitro, evaluamos si los PMN, una vez extravasados al sitio de infección, presentaban una grado de apoptosis mayor. Efectivamente, los PMN de los derrames pleurales tuberculosos tienen elevados niveles de apoptosis, no observándose el mismo efecto en derrames pleurales de patologías no relacionadas, a la vez que tienen una elevada expresión de la proteína p38 activada, por lo que concluimos que el fenómeno es característico de la enfermedad tuberculosa. Se sabe que en el contexto de una reacción inflamatoria pulmonar, el reclutamiento masivo de los PMN al foco infeccioso genera un daño tisular importante. Para evitar tanto el daño tisular como para resolver el proceso inflamatorio, es necesario remover oportunamente a estas células del pulmón. Por lo tanto, si la respuesta inflamatoria mediada por los PMN es regulada por la activación del proceso apoptótico se estaría controlando su potencial destructivo en el sitio de infección. En este trabajo demostramos que los PMN están activados antes de arribar al foco infeccioso y una vez allí, el encuentro con el Mtb dispararía una serie de señales que, moduladas a su vez por las CK presentes, activarían aún mas al PMN, como lo hemos observado en los derrames pleurales de etiología tuberculosa. Sin embargo, en un primer momento la apoptosis de los PMN extravasados sería contrarrestada por ciertas citoquinas como la IL-8, de manera tal, que en presencia del Mtb conservarían ciertos receptores, como el CD16, permitiendo al PMN extravasado mantener su capacidad efectora en el sitio inflamatorio. Posteriormente, la apoptosis inducida por el Mtb en los PMN se acelerarla rápidamente, promoviendo así la remoción de los PMN por los macrófagos alveolares y el control del proceso inflamatorio en el sitio de infección, lo que evitaría un mayor daño tisular.

Abstract:
Tuberculosis (TB) is a chronic inflammatory disease caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb). ln the early phase of infection, activation of cells of the innate immunity such as Natural Killer (NK) cells, Tγδ lymphocytes and neutrophils (PMN), as well as the cytokines (CK)secreted by them, modulate the course of the inflammatory reaction. PMN participate in the granuloma formation preceding monocytes in the areas of granulomatous inflammation and releasing chemokines that attract monocytes. Although tuberculosis lesions are characterized by a predominant migration of monocytes/macrophages to the site of infection, the earliest response to mycobacteria is primarily an influx of PMN. Nevertheless, as the disease evolves, an increased number of PMN is observed in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of affected lung that correlates with the interleukin (IL)-8 content. The production of this chemokine in macrophages is induced by interleukin (lL)-1β and tumor necrosis factor alpha (TNF)-α, that could induce in turn the secretion of other CK by PMN. It has been recently documented that PMN are able to kill Mtb in tuberculosis lesions. Once localized in the site of infection, the PMN underlie to death by two possible mechanisms: 1) necrosis: characterized by the release of the cytoplasmic content to the extracellular media generating an inflammatory response and 2) apoptosis: characterized by the preservation of the membrane integrity, so PMN might be removed by macrophages without releasing their cytotoxic content. More over, macrophages that phagocytes apoptotic cells do not release inflammatory mediators but anti-inflammatory molecules. On the other hand, apoptotic PMN loose some of their functions as degranulation, phagocytosis, respiratory burst and chemotaxis. Therefore, although PMN play a central role in the infectious process, the excessive recruitment of these cells generates tissue injury. In this context, apoptosis of PMN represents an effective mechanism that leads to the removal of undesirable cells by macrophages limiting tissue damage during the course of the inflammatory response. The aim of these studies was to investigate the activation state of circulating PMN of patients with active pulmonary tuberculosis (TB-PMN) and their possible contribution to the chronic inflammatory process. It is known that several functions that depend on the activation state leads to changes in second messengers that are associated with the induction of apoptotic process in PMN. Therefore, we evaluated apoptosis in circulating PMN and spontaneous and Mtb-induced apoptosis in vitro as well as the mechanisms involved in this process. Finally, in order to corroborate the findings observed in vitro, we evaluate the same parameters in pleural fluids of tuberculosis and non-tuberculosis diseases. Results demonstrated that: ▪ TB-PMN have an increased expression of (FcγR)-IIIB(CD16) and TNF-R55 compared to those of healthy subjects (N-PMN). Furthermore, FCγRI(C64) whose expression is almost exclusively restricted to mononuclear phagocytes, is observed in TB-PMN. Functions that depends on FCγR such as immune complex-mediated cytotoxicity (Cx-IC) and antibodydependent cellular cytotoxicity (CCDA), are also increased in circulating TB-PMN. ▪ On the other hand, in TB-PMN, superoxide anion generation are triggered even at chemottractant concentrations of the formylated peptide FMLP, suggesting that PMN of TB patients are activated and might release reactive oxygen intermediates (ROI) outside the site of infection so, we speculate that the chronic inflammatory response could no longer be considered solely as a local lung inflammation but it could contribute to a systemic inflammation in active TB patients. ▪ Although recently isolated TB-PMN show an elevated expression of CD16 and CD11b indicating that they are activated in circulation, they do not exhibit apoptotic features. ▪ Spontaneous apoptosis of TB-PMN is significantly increased and correlates with the loss of the CD16 receptor expression in culture (indicative of apoptosis in PMN). This spontaneous apoptosis could be due at least in part to the higher expression of Fas and/or the lower bcl-2 expression observed in TB-PMN compared to N-PMN. ▪ Mtb activates PMN in vitro enhancing the CD11b expression in N- and TB-PMN accelerating the apoptotic process in vitro. Moreover, activated TB-PMN are located in a new region characterized by a larger size and CD11b expression. This fact, lead us to speculate that accelerated spontaneous apoptosis of TB-PMN, could be due to the activation state that these cells have in circulation. ▪ Mtb-induced apoptosis of TB-PMN is initially delayed and correlates with the preservation of the CD16 receptor and with an increased secretion of IL-8. Later in the time of culture Mtb markedly accelerates the apoptotic process in TB-PMN. ▪ The pro-apoptotic effect of Mtb is not due to the major mycobacterial cell wall component, the glycolipid ManLAM. Furthermore, a whole cell lysate preparation has no effect on PMN apoptosis. Therefore, the whole Mtb triggers apoptotic process in PMN. ▪ Mtb-induced apoptosis in TB-PMN is not mediated by endogenous TNFα and does not involvs the CD11b receptor. ▪ Mtb-induced apoptosis in TB-PMN is dose dependent. Although phagocytosis induces high levels of apoptosis in PMN, we show that it is also induced at a low Mtb:PMN ratio (1:3). Therefore, Mtb-induced apoptosis might occur by the interaction with a receptor different from CD11b and does not depend on the phagocytosis of Mtb. ▪ mitogen-activated-protein-kinasa (MAPK)p38 and extracellular-signal-regulated kinase (ERK) ERK1/2 were analyzed because these proteins participate in cellular activation an survival. We demonstrated that p38 MAPK is involved in Mtb-induced apoptosis and not in spontaneous apoptosis. On the contrary, activation of ERK would be necessary to prevent the apoptotic process. In this context, some anti-apoptotic signal (i.e. IL-8) might have been annulated when ERK activation was blocked. ▪ Activated MAPK p38 (p-p38) expression in circulating TB-PMN is higher compared to N-PMN or to PMN of inflammatory non-related pathologies. ▪ TB-PMN in pleural fluid (PF) have an increased expression of activation markers as CD64, CD11b, TNF-R55 and a lower CD16 expression compared to peripheral blood PMN from the same patient. Furthermore, PMN that have migrated to the site of TB infection show high levels of apoptosis and a high p-p38 expression. On the contrary, we do not observe the same pattern in PMN of PF of inflammatory non-related pathologies suggesting that these features are characteristic of the tuberculosis disease. In the context of a pulmonary inflammatory reaction the massive recruitment of PMN to the infectious focus generates injury in the lung. Therefore, timer removal of PMN might avoid tissue damage and progression to chronic inflammation. Thus inflammatory response mediated by PMN in tuberculosis, is regulated by the activation of the apoptotic process limiting their detrimental potential in the lung. All these findings have a potential clinical relevance because PMN that have migrated to the site of inflammation are most likely to be either primed or activated before encountering mycobacteria. The delayed apoptosis at short culture times together with the preservation of CD16 suggest that PMN would be able to perform their effector functions at the site of infection. Likewise, later in time, Mtb-induced activation might lead to accelerated apoptosis of PMN, as can be observed in tuberculous pleuritis, thus avoiding tissue damage.

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Registro:
Título : Papel de los polimorfonucleares neutrófilos en el proceso inflamatorio crónico de la tuberculosis : efecto del Mycobacterium tuberculosis y mecanismos involucrados     =     : effect of Mycobacterium tuberculosis and mechanisms involved
Autor : Alemán, Mercedes
Director : Sasiain, María del Carmen
Año : 2003
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Academia Nacional de Medicina. Instituto de Investigaciones Hematológicas. Sección Inmunología
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3563_Aleman
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Biomedicina
Biología / Inmunología
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