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Ver el documento (formato PDF)   Espelt, María Victoria.  "Mecanismos que determinan la tolerancia a la anoxia celular"  (2003)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
En la presente tesis se estudió la relación entre el volumen celular y los flujos transmembranales de K+ en hepatocitos de goldfish (Carassius auratus) expuestos a condiciones anisosmóticas o a limitación energética. La respuesta de volumen fue luego comparada con aquella presentada por hepatocitos de trucha (Oncorhynchus mykiss) y de rata (Rattus rattus). El volumen celular fue estudiado utilizando video microscopía y microscopía de epifluorescencia, mientras que la medición de los flujos de K+ se estimó a partir de los flujos unidireccionales de 86Rb+. En hepatocitos de trucha y rata, la exposición a medio hiposmótico (180 mosM) a pH 7.45 produjo el aumento de volumen celular seguido por disminución regulatoria de volumen (RVD), respuesta que es mediada por el eflujo neto de KCl seguido de agua. Por el contrario, los hepatocitos de goldfish aumentaron su volumen pero no presentaron RVD en esas condiciones. En hepatocitos de goldfish, si bien la N-etilmaleimida pudo activar la salida de K+, esto no ocurriió cuando las celulas fueron expuestas a medio hiposmótico (120-180 mosM). Se desarrolló un modelo matemático con el fin de analizar las interacciones existentes entre el volumen celular, el potencial de membrana, y la masa de los principales solutos difusibles bajo condiciones anisosmóticas. Este modelo pudo ser utilizado para simular las respuestas volumétricas de los hepatocitos de las tres especies. Los resultados del modelo apoyan la idea de que la ausencia de RVD observada en hepatocitos de goldfish se debe a la ausencia de un elemento sensor de volumen. La comparación entre los resultados obtenidos con el modelo matemático y los resultados experimentales sugiere que los hepatocitos de goldfish poseen una capacidad restringida para desarrollar RVD. El bloqueo de metabolismo energético puede generar gradientes osmoticos por aumento de la osmolaridad intracelular. En el presente estudio, la inhibición de la glucólisis por ácido iodoacético (IAA)no alteró el volumen celular en hepatocitos de goldfish, mientras que en presencia de cianuro (CN), inhibidor de la fosforilación oxidativa, o de CN y IAA (IAA+CN), el volumen celular disminuyó un 3—7%.A pesar de que en los hepatocitos de goldfish la limitación energética no tuvo efecto sobre el eflujo de K+, el influjo disminuyó un 57-66% en presencia de CN y CN+IAA pero no se vio alterada por el IAA sólo. La pérdida de K+ intracelular luego de 20 min de exposición a CN o IAA+CN fue solo de un 4% del K+ intracelular total. En general, los resultados de este estudio sugieren que los hepatocitos de goldfish, a diferencia de las células de especies sensibles a la anoxia, evitan el desacople de los flujos transmembranales de K+ en respuesta a un gradiente osmótico o limitación energética. Esto podría explicar por un lado la incapacidad de estas células para presentar RVD, pero al mismo tiempo la extraordinaria capacidad para mantener las concentraciones intracelulares de K+, prolongando de esta manera la viabilidad celular.

Abstract:
The relationship between cell volume and K+ transmembrane fluxes of goldfish (Carassius auratus) hepatocytes exposed to anisosmotic conditions or energetic limitation was studied, and compared with the volumetric response of hepatocytes from trout (Oncorhynchus mykiss) and rat (Rattus rattus). Cell volume was studied by video- and epifluorescence microscopy, while K+ fluxes were assessed by measuring unidirectional 86Rb+ fluxes. In trout and rat hepatocytes, hyposmotic (180 mosM) exposure at pH 7.45 caused cell swelling followed by a regulatory volume decrease (RVD), a response reported to be mediated by net efflux of KCI and osmotically obliged water. In contrast, goldfish hepatocytes swelled but showed no RVD under these conditions. Although in goldfish hepatocytes a net K+ efflux could be activated by N-ethylmaleimide. this flux was not, or only partially, activated by hyposmotic swelling (120-180 mosM). A mathematical model was developed in order to gain insight into the multiple interactions between cell volume, membrane potential and the masses of diffusible solutes under anisosmotic conditions. This model was successfully used to simulate the volumetric responses of hepatocytes from the three species. Results from the model gave support to the idea that the lack of RVD observed in goldfish hepatocytes is due to the absence of a volume sensor element. A comparison between data predicted by this model and that obtained experimentally suggests that goldfish hepatocytes have a limited capacity to enable RVD. Blockage of the metabolism can be viewed as an osmotic challenge where intracellular osmolarity may increase. In the present work, the inhibition of glycolysis by iodoacetic acid (IAA)did not alter cell volume in goldfish hepatocytes, whereas in the presence of cyanide (CN), an inhibitor of oxidative phosphorylation, or CN plus IAA (IAA+CN), cell volume decreased by 3—7%. While in goldfish hepatocytes, energetic limitation had no effect on K+ efflux, K+ influx decreased by 57-66% in the presence of CN and CN+IAA but was not significantly altered by IAA alone. Intracellular K+ loss after 20 min of exposure to CN and IAA+CN amounted to only 4% of total intracellular K+. Collectively, these observations suggest that goldfish hepatocytes, unlike hepatocytes of anoxia-intolerant species, avoid a decoupling of transmembrane K+ fluxes in response to an osmotic challenge. This may underlie both the inability of swollen cells to undergo RVD but also the capability of anoxic cells to maintain intracellular K+ concentrations almost unaltered, thereby prolonging cell survival.

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Registro:
Título : Mecanismos que determinan la tolerancia a la anoxia celular    
Autor : Espelt, María Victoria
Director : Schwarzbaum, Pablo J.
Director Asistente : Amodeo, Gabriela
Año : 2003
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Quimica y Fisicoquímica Biológicas
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3574_Espelt
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Biología Molecular y Celular
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