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Ver el documento (formato PDF)   Alonso, Diana Graciela.  "Desarrollo y diferenciación de las branquias externas e internas en embriones y larvas de Bufo arenarum : análisis descriptivo y experimental"  (2003)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
Las branquias externas de anuros son estructuras respiratorias embrionarias que desaparecen en las larvas, mientras que las branquias internas permanecen hasta la metamorfosis. La morfología branquial fue estudiada con microscopio óptico en embriones y larvas de Bufo arenarum. Los filamentos branquiales externos se originan a partir de los arcos vicerales 3 a 5 embrionarios; estos filamentos presentan una doble capa epidérmica, células mesenquimáticas y algunos capilares. Las branquias son recubiertas por completo por el opérculo en el estadio 25 y finalmente desaparecen. Los cuatro pares de braquias internas se encuentran ubicadas en dos cámaras branquiales a cada lado del corazón; cada branquia esta formada por un arco branquial en el cual se insertan ventralmente los filamentos respiratorios y dorsalmente los filtros branquiales. Cada filamento esta compuesto por un eje y numerosas ramificaciones, que presentan una cobertura epitelial, tejido conectivo, vasos sanguíneos y capilares mesodérmicos. El sistema branquial es sostenido por el cartílago del arco branquial; por debajo se encuentran las arterias branquiales aferentes y eferentes y el músculo constrictor. Si bien el proceso de regresión de las branquias internas de anuros ha sido bastante dilucidado, la desaparición de las branquias externas ha sido poco estudiada hasta el momento. La apoptosis es un tipo de muerte celular presente durante el desarrollo embrionario, caracterizada por la fragmentación de ADN. En el presente trabajo, células apoptóticas fueron estudiadas en el epitelio de las branquias externas con el microscopio óptico, y fueron detectados in situ fragmentos de ADN a través de la técnica TUNEL. La presencia y distribución de núcleos marcados fue mayor en los estadios 24 y 25, aunque tambien se encontraron en los restantes estadios embrionarios analizados. Un ensayo inmunohistoquímico para detectar PCNA (proliferating cell nuclear antigen) identifica células en todas las fases activas del ciclo celular. En este estudio, esta metodología permitió marcar las células proliferativas en tejidos embrionarios del sistema branquial, durante la regresión de las branquias externas. La presencia de apoptosis en el epitelio de las branquias externas progresa simultaneamente con una activa proliferación en las branquias internas. Los resultados obtenidos muestran la importancia de la apoptosis en la regresión de las branquias externas, ya que este tipo de muerte celular parece ser el proceso principal para reajustar el número celular del epitelio branquial, preparandolo para el nuevo sistema respiratorio de las larvas No existe información previa acerca de la distribución de componentes del citoesqueleto en las branquias de anuros. Con el objeto de conocer la distribución de algunos de las principales proteínas citoesqueletales en las branquias de Bufo arenarum; se efectuó una ensayo inmunocitoquímico en las branquias externas e internas. Se observó inmunorreacción para actina en el epitelio y tejido conectivo; la inmunodetección a miosina estuvo restringida al tejido conectivo de las branquias internas. Se encontró expresión de a y b tubulinas en el epitelio y las células ciliadas. La inmunocoloración para la vimentina fue débil en las células epiteliales e intensa en el tejido conectivo. La inmunorreacción positiva para las citoqueratinas de bajo peso molecular se encontró en los epitelios branquiales y en otros tejidos que en vertebrados superiores expresan vimentina, como el endotelio de los vasos y células musculares. Los resultados obtenidos demuestran que existe una gran diversidad de elementos en el citoesqueleto de las branquias larvales de anuros. El desarrollo de las branquias de anfibios es un excelente modelo de estudio de las interacciones entre las capas germinales de los embriones. Con el objeto de analizar la capacidad de diferenciación, especificación y determinación del esbozo branquial en el estadio de botón caudal, se llevaron a cabo explantes y transplantes en embriones de Bufo arenarum. Los esbozos transplantados desarrollaron filamentos análogos a los observados en las branquias externas e internas, incluso funcionalmente. Los explantes de endo-mesodermo fueron capaces de diferenciar tejidos branquiales típicos, en presencia de distintos ectodermos; el ectodermo presuntivo branquial en forma aislada no diferenció ninguna estructura. En los embriones explantados, el desarrollo de las branquias externas fue impedido tanto por la ausencia del ectodermo como del endo-mesodermo branquial. La diferenciación de las branquias internas solo fue afectada por la pérdidad del endo-mesodermo del esbozo. Estos resultados sugieren que el ectodermo branquial presuntivo se encuentra definido en el estadio de botón caudal, pero es incapaz de diferenciar estructuras branquiales en ausencia del end- mesodermo. Los Factores Natriuréticos Atriales son una familia de péptidos vasodilatadores, diuréticos y natriuréticos, cuya presencia ha sido demostrada en el corazón de larvas y adultos de Bufo arenarum. En el presente estudio, se efectuó un análisis ultraestructural e inmunhistoquímico acerca de la presencia de FNAs en las branquias internas de larvas premetamórficas. Los resultados del estudio inmunocitoquímico indican que en el estadio II larval y subsiguientes, se encuentran células inmunorreactivas en las branquias internas. A nivel ultraestructural, se encontraron en las células claras de los filtros branquiales gránulos secretorios similares a los gránulos FNA-inmunorreactivos de las células mioendócrinas de la misma especie. Estas observaciones permiten suponer que las hormonas cardíacas podrían jugar un rol paracrino y/o autocrino en el balance osmótico y electrolítico a nivel de las branquias internas.

Abstract:
In anuran larvae external gills are embryonic structures that regress at hatching or shortly thereafter; but internal gills are retained much longer, until metamorphosis. The morphology of gills was studied under light microscopy in Bufo arenarum embryos and tadpoles. The extenal gills filaments originate on visceral arches 3 to 5 just before the heartbeat stage; they have a two-layered epidermis, mesenchymal cells and some capillary loops are present. These gills are covered by the operculum at the 25 stage and they finally disappear. The four pair internal gills are located in two branchial baskets on either side of the heart; each gill consist of a branchial arch with gill tufts projecting ventrally and gill filters running dorsally. Each gill tuft is composed of a stem and numerous ramifications; it consists of an epithelial covering, connective tissue, the blood vessels and mesodermal capillaries. The gill system is supported by cartilage of the branchial arch; the afferent and efferent branchial arteries and the musculus constrictor branchialis extend beside the arches. Although the regression of internal gills of anurans is well understood, the loss of the external gills was poorly studied. Apoptosis is a form of naturally occurring cell death during development and it is characterised by extensive DNA fragmentation. In the present work, apoptosis was detected in the epithelium of external gills by light microscopy and using in situ nick end-labelling of DNA breaks. The presence and distribution of stained nuclei were frequent at 24-25 stages, but it were also present during the other embrionic stages. An immunohistochemical assay for proliferating cell nuclear antigen (PCNA) identifies cells in all active phases of the cell cycle. In this study, PCNA methodology marked cells in embryonic proliferating tissues of branchial system, during the involution of external gills. . Epithelial apoptosis of the external gills progresses simultaneously with active proliferation of the internal gills. These results show the relevance of apoptosis at regression of external gills, when this kind of death seems to be the unique process by wich cell numbers in the gill epithelium are adjusted, in order to prepare for the new respiratory system of tadpoles. There is no information about the distribution of cytoskeletal components in the anuran gills. The aim of this work was to know the distribution of some major cytoskeletal proteins in Bufo arenarum gills; an immunocytochemical study was performed in external and internal gills. Actin immunoreaction was observed in epitelia and connective tissue;.immunodetection to myosin was restricted to connective tissue of the internal gills. Expression of a and b tubulins was found in epithelia and cilliated cells. Vimentin immunostaining was weak in the epithelial cells and intense in the connective tissue. Immunoreaction to some small cytokeratins was observed in epithelia and other tissues that in higher vertebrates express primarily vimentin; such tissues were endothelia and certain muscle cells. It is concluded that the diversity of cyotskeleton has already been established in gills of lower vertebrates such as anuran larvae. The development of amphibian gills is an excellent model for studying the interactions between the germ layers of embryos. In order to analyze the differentiation capacity, specification and determination stage of the branchial rudiment at tail bud stage, explants and transplants were performed in Bufo arenarum embryos. Rudiments transplanted developed filaments analogous to the ones observed in external and internal gills, even functionally. Endo-mesoderm explants were able to differentiate typical branchial tissues, in presence of diferent ectoderm; the isolated pressumptive gill ectoderm did not differentiate any structure. In the explanted embryos, development of external gills was prevented by either the absence of branchial ectoderm or the meso-endoderm. Differentiation of the internal gills was only affected by the lack of the intenal layers of the rudiment. These results suggest that the presumptive branchial ectoderm is defined by the tail bud stage, but is unable to differentiate branchial structures in the absence of meso and endoderm. Atrial Natriuretic Factors are a family of vasodilatadory, diuretic and natriuretic peptides, whose existence has been demonstrated in the heart of larval and adult amphibians, including Bufo arenarum. In this study, an ultrastructural and immunohistochemical analysis was carried out on the presence of ANF-like substance in the internal gills of premetamorphic larval stages. The results of immunohistochemical study indicate that, at larval II and following stages, ANF-like immunoreactive cells are seen in internal gills. At electron-microscopy level secretory granules similar to those ANF-immunoreactive granules of myoendocrine cells of the same species are seen only in clear cells of gill rakers. These observations support the hypothesis that cardiac hormones might play a paracrine and/or autocrine role in the water and electrolyte balance at internal gills level.

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Registro:
Título : Desarrollo y diferenciación de las branquias externas e internas en embriones y larvas de Bufo arenarum : análisis descriptivo y experimental    
Autor : Alonso, Diana Graciela
Director : Paz, Dante Agustín
Jurados : Guerrero, G.  ; Echeverría, D.  ; Herkovits, J.
Año : 2003
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental
Instituto de Neurociencias
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3581_Alonso
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Embriología Animal
Palabras claves : BUFO ARENARUM; EMBRIONES; BRANQUIAS EXTERNAS; BRANQUIAS INTERNAS; APOPTOSIS; CITOESQUELETO; CITOQUERATINAS; ESBOZOS BRANQUIALES; FACTORES NATRIURETICOS ATRIALES; BUFO ARENARUM; EMBRYOS; TADPOLES; GILLS; APOPTOSIS; CYTOSKELETON; CYTOKERATINAS; GILLS RUDIMENTS; ATRIAL NATRIURETIC FACTOR
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