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Ver el documento (formato PDF)   Goldberg Cavalleri, Alina Viviana.  "Estudio biológico y molecular del proceso de infección de un virus de la granulosis de Epinotia aporema y evaluación de su potencial como agente de control biológico"  (2003)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
El “barrenador de los brotes", Epinotia aporema, es una de las principales plagas de leguminosas en América del Sur. Las larvas de esta plaga, son infectadas por un granulovirus (EpapGV) el cual representa una de las principales causas de epizootias esporádicas en poblaciones de E. aporema. En el trabajo de tesis, se realizaron estudios biológicos y patológicos sobre EpapGV en larvas del insecto huésped, los cuales establecieron una base de conocimientos importante para determinar distintos aspectos de la interacción virus-huésped. Ensayos en laboratorio demostraron que el virus es altamente virulento y especie específico, lo que indica que es un buen candidato para ser utilizado en el control biológico de la plaga. Larvas infectadas con EpapGV sufrieron un retraso en el desarrollo, siendo inhibido el proceso de muda. Además, exhibieron un incremento en el peso mayor al observado en larvas sin infectar. Esto pudo deberse a la expresión del gen viral egt cuyo producto altera la fisiología de los insectos. Mediante exámenes de tejidos al microscopio óptico y electrónico, por medio de las técnicas de inmunohistoquimica e hibridación in situ (ARN-ARN), se observó que EpapGV causa infecciones de tipo poliorganotrópicas. Los principales tejidos afectados fueron el adiposo, la epidermis y la matriz traqueal. Luego de infectar el intestino medio, la diseminación del virus hacia otros tejidos se produce aparentemente vía hemolinfa. Los viriones producidos en células infectadas se acumulan entre la membrana plasmática y la lámina basal, lo que indica que dicha lámina constituye una barrera efectiva para diseminación de la infección. Mediante la técnica de inmuno-oro se detectó expresión de granulina dentro del núcleo, lo cual indica que la expresión de genes tardíos ocurre luego de la ruptura de la membrana nuclear. Análisis computacional de las secuencias de los extremos de clones de la biblioteca genómica de EpapGV generada en el laboratorio, permitieron identificar una posible proteína de fusión (Epap-F). El gen completo fue subclonado, secuenciado y analizado mostrando motivos característicos de las proteinas F de Nucleopolyhedrovirus (involucradas en la entrada del virus a una nueva célula). Sin embargo, no se había demostrado la funcionalidad de proteínas F de Granulovirus. Mediante la técnica de Northern blot se confirmó la expresión de dicho gen y se estudió su expresión temporal. Posteriormente, a través de la técnica de RACE, se mapeó el extremo 5' no codificante demostrándose que la transcripción del gen se realiza a partir de un motivo típico de transcripción tardío (CAGT) y también a partir de un motivo no convencional ATGC. Para demostrar la actividad fusogénica de dicha proteína se realizó un ensayo de actividad transiente in vitro. Para ello, se transfectó un cultivo de células (Spodoptera frugiperda. Sf21) con un plásmido conteniendo el ORF completo de Epap-F bajo el promotor ie-1 de Anticarsia gemmatalis MNPV, se modificó el pH del medio a 5 y se registró formación de sincicios. Con el fin de producir anticuerpos que reconozcan a Epap-F, se expresó dicha proteína utilizando un sistema de expresión de baculovirus. Los anticuerpos serán utilizados para la determinación de la ubicación subcelular de dicha proteína.

Abstract:
The bean shoot borer, Epinotia aporema, is a major pest of legume crops in South America. Larvae of this pest are infected by a granulovirus (EpapGV) that is the most important cause of sporadic epizooties in E. aporema populations. This PhD dissertation deals with the biological and pathogenesis studies on EpapGV on the host larvae that provide the basic information of the virus-host interaction. The high specificity and pathogenicity indicate that EpapGV is a good candidate for the biological control of this pest. Larvae infected by EpapGV, suffered a retardation of development and typically failed to pupate, but exhibited a weight increase greater than that of healthy larvae. It is possible that the effect observed was due to the expression of the egt viral gene whose product alters the insect physiology. Using immunohistochemistry and in situ hybridization (by both, light and electron microscope) we observed that EpapGV caused a polyorganotropic infection. We found that the fat body, epidermis and tracheal matrix were the main tissues infected. Virions liberated from the midgut may gain entry to other tissues via circulation through hemolymph. Virions produced by infected cells accumulated between the plasma membrane and basal lamina, this indicated that the basal lamina is an effective barrier for the spread of the infection. Granulin was detected in the nucleus by immuno-gold staining. indicating that late gene expression occurred prior to nuclear membrane disruption. Computer-assisted analysis of the sequence of the end sequences EpapGV clone library produced in our lab, revealed a putative fusion protein (Epap F). The complete gene was subcloned, sequenced and analyzed revealing aminoacids motif of characteristic for Nucleopolyhedrovirus F proteins (involved in virus entry to a new cell). However no functional F protein had been demostrated in any Granulovirus. Northern blots were used to confirm the transcription of this gene and to study its temporal expression. Employing the RACE technique we mapped the 5' untranslated region and we found that the transcription starts at a typical late gene (CAGT) motif and also at an unconventional (ATGC) motif. In order to demonstrate the fusion activity of Epap-F, we carried out a transient expression assay. To this end, a Spodoptera frugiperda (Sf 21) cell line was transfected with an expression plasmid containing the Epap-F ORF under the control of the Anticarsia gemmatalis MNPV ie-1 promoter and, alter lowering the pH to 5 many extensive syncytia were observed. With the aim of producing antibodies against Epap-F, the protein was expressed using a baculovirus expression system. The antibodies will be used to determine the subcelular localization of this protein.

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Registro:
Título : Estudio biológico y molecular del proceso de infección de un virus de la granulosis de Epinotia aporema y evaluación de su potencial como agente de control biológico    
Autor : Goldberg Cavalleri, Alina Viviana
Director : Romanowski, Víctor
Director Asistente : Sciocco de Cap, Alicia
Año : 2003
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Instituto Nacional de Tecnología Agrícola (INTA) Castelar. Instituto de Microbiología y Zoología Agrícola
Universidad de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Bioquímica y Biología Molecular
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3582_GoldbergCavalleri
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Control Biológico
Biología / Biología Molecular y Celular
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