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Ver el documento (formato PDF)   Cerutti, María Laura.  "Desarrollo y caracterización de anticuerpos contra un factor de transcripción viral unido a su ADN específico"  (2003)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
El lupus eritematoso sistémico es una enfermedad autoinmune de etiología desconocida. El rasgo principal de esta enfermedad es la presencia de anticuerpos dirigidos contra componentes nucleares, como histonas y ADN doble cadena. En los últimos años, se ha demostrado que varios complejos proteína: ADN pueden inducir una respuesta autoimmune contra ADN en ratones normales, no-predispuestos a desarrollar autoinmunidad. En este trabajo de tesis se describe el desarrollo de un modelo de inmunización con un complejo proteína: ADN molecularmente definido y la caracterización de la respuesta inmune generada contra él en animales normales. En particular, se utilizó el complejo formado por el dominio C-terminal del factor de transcripción E2 del papilomavirus humano y un olígonucleótido doble cadena de 18 pb comprendiendo uno de sus sitios de reconocimiento específico dentro del genoma viral. El análisis de la respuesta inmune humoral de ratones inmunizados con la proteína E2 libre o unida a ADN indica que ésta es una proteína altamente inmunogénica. La inmunización con E2 libre emulsionada en un adyuvante de composición aceite-en-agua resulta en una respuesta policlonal dirigida hacia el reconocimiento de epitopes discontinuos, sugiriendo que la naturaleza acuosa del adyuvante es el responsable de mantener a la proteína en su conformación nativa. El estudio de la respuesta policlonal contra ADN desarrollada en los ratones inmunizados con este complejo proteína: ADN señala que el olígonucleótido específico puede adquirir potencial inmunogénico sólo cuando el complejo es incubado a altas concentraciones por un largo período de tiempo. En estos casos, los ratones inmunizados desarrollaron altos títulos de IgG anti-oligonucleótido durante una respuesta T-dependiente clásica. Además, la inmunización con la proteína E2, ya sea libre o unida a su secuencia de reconocimiento, resultó en una respuesta autoinmune contra ADN nativo doble cadena. Estos resultados son congruentes con la hipótesis de que proteínas virales con capacidad de unir ADN tendrían el potencial necesario para iniciar el desarrollo de la enfermedad autoimmune lupus eritematoso sistémico. A partir de uno de los animales inmunizados con el complejo E2: ADN han sido obtenidos y caracterizados seis anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína viral y dos anticuerpos contra el olígonucleótido específico. En coincidencia con el patrón de reactividades observado en la respuesta políclonal, la mayoría de los hibridomas anti-E2 reconocen epitopes discontinuos en la proteína. Los estudios de mapeo epitópico-funcional realizados sobre estos anticuerpos monoclonales revelan que se han obtenido dos grandes poblaciones de anticuerpos: una formada por anticuerpos capaces de formar un complejo temario estable con E2 y el oligonucleótido, y otra población formada por anticuerpos que reconocen un epitope, parcial o totalmente, superpuesto con la superficie de unión a ADN en el factor de transcripción, interfiriendo en su interacción con ADN. Estudios detallados de la interacciones anti-ADN: ADN muestran que los dos anticuerpos monoclonales anti-ADN generados reaccionan contra el oligonucleótido utilizado como inmunógeno con afinidades comparables a las del factor de transcripción E2. Por el contrario, estos anticuerpos unen con muy baja afinidad moléculas de ADN no-relacionadas doble cadena del mismo largo. Más aún, ambos anticuerpos unen al oligonucleótido libre y acomplejado a E2 con afinidades muy similares, formando un complejo temario estable. La estructura de las regiones variables y el patrón de mutaciones de la secuencia de estos anticuerpos indica que éstas son muy similares a las encontradas en anticuerpos anti-ADN generados en modelos murinos de lupus. En conjunto, todos estos resultados sugieren fuertemente que estos anticuerpos monoclonales anti-ADN son el producto de una respuesta inmune dirigida por el antígeno, en el cual el complejo E2: ADN actuó como una nueva entidad inmunogénica.

Abstract:
Systemic lupus erythematosus is an autoimmune disorder with unknown etiology. The major hallmark of this disease is the presence of antibodies against nuclear components, including double-stranded DNA and histones. In the last years, several protein: DNA complexes have been shown to induce anti-DNA antibodies in normal, nonautoimmune-predisposed mice. This PhD thesis describes the development of an immunization model using a molecularly defined protein: DNA complex and the characterization of the immune response generated against it in non-autoimmune mice. In particular, a complex formed by the C-terminal domain of the human papillomavirus E2 transcription factor and a cognate 18 bp double stranded oligonucleotide corresponding to one of its recognition sites in the viral genome has been used. Analysis of the humoral immune response of mice challenged with free or bound E2 indicates that this is a very immunogenic protein. Immunization with free E2 emulsified in an oil-in-water adjuvant elicits a strong humoral response shifted to the recognition of discontinuous epitopes, suggesting that the aqueous nature of this adjuvant emulsion is responsible for keeping the protein in its native conformation. Analysis of the induced polyclonal anti-DNA response indicates that the specific oligonucleotide can acquire immunogenic potential only when the complex is incubated under high concentrations for a long-term period. In this case, the immunized mice develop high IgG anti-oligonucleotide sera titers during a typical T-dependent immune response. Besides, immunization with free or DNA complexed E2 protein also results in an autoimmune response to native double stranded DNA, supporting the hypotesis that viral DNA-binding proteins may have the potential to initiate the development of the autoimmune disease Systemic lupus erythematosus. From one of the E2: DNA complex immunized mice there has been obtained and characterized six monoclonal antibodies against the viral protein and two against the specific oligonucleotide. According with the pattern of reactivity observed in the polyclonal response, most anti-E2 hybridomas recognize discontinuous epitopes on the protein. Epitope mapping and functional analysis of these monoclonal antibodies reveals that two separate antibodies populations can be obtained: one formed by antibodies able to form a stable ternary complex with protein and the oligonucleotide, and other in which the antibodies recognize an epitope totally or partially overlapped with the DNA-binding surface of the transcription factor, interfering with its interaction with DNA. Detailed studies of the anti-DNA: DNA interactions showed that the two generated anti-DNA monoclonal antibodies react against the double stranded oligonucleotide used as immunogen with affinities comparable to that of the transcription factor. In contrast, they bind with low affinities with unrelated double stranded DNAs of the same length. Furthermore, they bind with almost the same affinity towards the free or E2 bound oligonucleotide, forming a stable ternary structure. The variable region structures and mutation pattern of the anti-DNA antibodies sequences indicate that they are similar to the anti-dsDNA antibodies described on murine models of systemic lupus erythematosus. Taken together these results strongly suggest that these anti-DNA monoclonal antibodies are the product of an antigen-driven immune response, in which the E2: DNA complex acted as an new immunogenic entity.

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Registro:
Título : Desarrollo y caracterización de anticuerpos contra un factor de transcripción viral unido a su ADN específico    
Autor : Cerutti, María Laura
Director : Goldbaum, Fernando A.
Año : 2003
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Fundación Campomar. Instituto de Investigaciones Bioquímicas (IIB)
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Químicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3589_Cerutti
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Inmunología
Palabras claves : INMUNIZACION; ADYUVANTE; COMPLEJO PROTEINA : ADN; AUTOINMUNIDAD; ANTICUERPOS ANTI-ADN; FACTOR DE TRANSCRIPCION; PAPILOMAVIRUS; INMUNIZATION; ADJUVANT; PROTEIN : DNA COMPLEX; AUTOIMMUNITY; ANTI-DNA ANTIBODIES; TRANSCRIPTION FACTOR; PAPILLOMAVIRUS
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