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Ver el documento (formato PDF)   Piuri, Mariana.  "Caracterización de la respuesta a estrés osmótico en Lactobacillus casei : rol del sistema proteolítico"  (2003)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
Lactobacillus casei es una bacteria que desde larga data ha sido empleada por el hombre en procesos fermentativos para la producción de quesos y chacinados y en los últimos años ha adquirido gran relevancia por su uso como probiótico. Durante los procesos mencionados y en el tracto gastrointestinal, Lb casei es sometida a diferentes tipos de estrés, entre ellos el estrés osmótico. El objetivo de este trabajo fue estudiar las modificaciones genéticas, fisiológicas y estructurales de este microorganismo cuando es sometido a un estrés hipersalino, priorizando el estudio de las actividades relacionadas con los procesos de elaboración de alimentos. En esta tesis se demostró que además de los solutos osmocompatibles generales glicín betaína y camitina, di y tripétidos pueden aumentar la osmotolerancia de Lb casei. Además de estimular el crecimiento en un medio hiperosmótico lograron restituir el grado de superenrollamiento del ADN (recuperación del linking number) de modo análogo a la camitina. La construcción y el análisis de una mutante deficiente en el transporte de di-tripéptidos, dtpT, mostró que aquellos péptidos que no son transportados eficientemente no ejercen osmoprotección, mientras que sí lo ejercen aquellos que son transportados de manera eficiente. Así mismo, se describió la pérdida de la represión ejercida por péptidos en las actividades de PrtP y Per , dos de las enzimas principales del sistema proteolítico y principales proveedoras de péptidos en el extracelular e intracelular respectivamente. En el caso de PrtP, se pudo demostrar que el aumento de la actividad se debe a una pérdida de la represión a nivel transcripcional. La demostración de la interacción de CodY (que había sido postulado como el efector de la represión por péptidos de varios componentes del sistema proteolítico en Lactococcus lactis) de Lb casei con la región promotora de prtP apunta a que ésta proteína reguladora mediaría la pérdida de represión en medio hiperosmótico. En un medio carente de péptidos y en alta sal, en cambio, la elevada actividad de PrtP se debe a un aumento de la velocidad máxima de la enzima durante el crecimiento en alta sal y no a un aumento de la actividad transcripcional. Dado que PrtP se encuentra anclada a la pared celular, la modificación de la actividad de la enzima podría ser consecuencia de modificaciones en el entorno de la proteína. Se describió una sensibilidad diferencial a la lisis y a antibióticos que actúan a nivel de envolturas en células provenientes de un medio con alta sal. El aumento de la sensibilidad a la lisis se debe directamente a alteraciones de la pared, ya que el mismo efecto se observó al emplear paredes purificadas. El análisis de las fotografias de microscopía electrónica reveló un aumento en el tamaño de las células crecidas en alta sal y claras diferencias en la pared de la misma. De estos resultados, se desprende la posibilidad de emplear el precrecimiento en NaCl como un método para facilitar la lisis de un microorganismo que normalmente es resistente a la misma. Los resultados obtenidos en esta tesis, contribuyen al conocimiento de la fisiología de bacterias lácticas en presencia de un efector de estrés que normalmente se encuentra durante los procesos en los que estos microorganismos participan.

Abstract:
Since long time, Laclobacillus casei has been used for the production of Cheese and sausages. In and the last few years they acquired relevance because of its use as a probiotic. During the fermentation process and in the gastrointestinal tract, Lb casei is subjected to a wide range of stressors and particularly to osmotic stress. The aim of this work was the analysis of the genetic, physiological and structural changes in this microorganism when it grows in a hyperosmotic saline condition, mainly the study of those activities related to the process involved in food production. In this thesis, it was demonstrated that as well as generally osmocompatible solutes, camithine and glycin betaine, di and tripeptides can improve osmotolerance in Lb. casei. Besides their role in stimulation of growth in high osmolarity media, they were able to re-establish the degree of DNA supercoil (recovery of linking number) as camithine did. The construction and analysis of a mutant,dtpT, unable to transport di-tripeptides, enable to show that those inefficiently transported peptides can not exert an osmoprotective role, in distinction from those efficiently transported. The lost of the repression exerted by peptides in PrtP and Per activities, two of the key enzymes of the proteolytic system and main providers of peptides was described. The lost of repression for PrtP took place at the transcriptional level. The interaction of CodY protein of Lb casei with the promoter region of prtP gene was demonstrated, this result suggests that this regulator protein would be involved in the lost of repression by peptides in a hyperosmotic media. In a hypersaline media in the absence of peptides, the high levels of PrtP activity were essentially through an increase of apparent Vmax instead of an increment of transcriptional activity. Since PrtP is anchored to the cell wall, the enzyme activity could be related to changes in the environment of the protein. The differences in the sensitivity to lysis and antibiotics, that exert their effect on the cell envelope in cells grown in the presence of salt, were indicative of these variations. The high level of lysis of the cells grown in NaCl, was also a direct consequence of changes in the cell wall; the same effect was observed when purified cell walls were used instead of whole cells. The analysis of electronic microscopy photographs revealed and increase in the size of cells grown in high salt as well as clear differences in the cell wall. These results raises, that pregrowth in hyperosmotic media could be used as an efficient method to improve lysis of this resistant to lysis bacteria. The results of this study, increase the knowledge about lactic acid bacteria physiology in the presence of NaCl, a stress effector that is usually found in fermentative process.

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Registro:
Título : Caracterización de la respuesta a estrés osmótico en Lactobacillus casei : rol del sistema proteolítico    
Autor : Piuri, Mariana
Director : Sanchez Rivas, Carmen
Año : 2003
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Química Biológica (DQB). Laboratorio de Microbiología
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Químicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3599_Piuri
Idioma : Español
Area Temática : 
Palabras claves : LACTOBACILLUS CASEI; ESTRES OSMOTICO; SISTEMA PROTEOLITICO; PrtP; PepX; DtpT; CodY; PARED CELULAR; LACTOBACILLUS CASEI; OSMOTIC STRESS; PROTEOLYTIC SYSTEM; PrtP; PepX; DtpT; CodY; CELL WALL
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