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Ver el documento (formato PDF)   Lamb, Caroline A..  "Mecanismos involucrados en la adquisición de la hormono-independncia : interacción entre receptores de progesterona y otras vías de señalización"  (2003)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
En este trabajo de Tesis se evaluaron las siguientes hipótesis: 1. El receptor de progesterona (RP) está involucradoen el crecimiento tumoral progestágeno-independiente (PI). 2. Vias preliferativas activadas por factores de crecimiento activan al RP. 3. Factores del estrema tumoral participan en la transición hacia la hormono-independencia activando RP. 4. Los receptores de estrógenos alfa (REα) tienen un rol en el crecimiento tumoral pregestágeno-dependiente (PD). Los ensayos se realizaron en un modelo experimental de inducción de cáncer de mama por administración prolongada de acetato de medroxiprogesterona (MPA) en ratones hembras vírgenes de la cepa BALB/c. Los tumores utilizados fueron todos carcinomas ductales metastáticos con alto contenido de RE y RP, que se comportan como hormono-dependientes en los primeros pasajes subcutáneos singeneicos, creciendo sólo en presencia de progestágenos. En pasajes sucesivos pueden adquirir un fenotipo progestágeno-independiente, independizándose del requerimiento de hormonas, pero aún así mantienen la expresión de RE y RP. Un estudio de comportamiento de una serie de tumores PI, nos condujo a subclasificarlos en respondedores (PI-R) o no respondedores (PI-NR) (Helguero y col. Breast Cancer Res and Treat 79: 379-390, 2003) de acuerdo a la sensibilidad in vivo para regresionar con el tratamiento a antiprogestágenos. Para evaluar si existen factores de crecimiento capaces de reemplazar a los progestágenos en la estimulación de la proliferación celular en cultivos primarios de un tumor PD, el CC4-HD, usamos al bFGF y bloqueamos el RP mediante el uso de antiprogestágenos (RU 486 y ZK 299) y mediante el uso de oligonucleótidos antisentido. En todos los casos el bloqueo del RP inhibió la proliferación celular inducida por MPA, factores séricos o bFGF, de manera específica. Resultados similares se obtuvieron utilizando cultivos primarios de 3 tumores PI diferentes: 59-2-HI, C7-2-HI y CC4-HI. Estudios de Mobility Gel Shift confirmaron que tanto el MPA como el bFGF pueden inducir la activación del RP en células en cultivo y que los mismos se encuentran constitutivamente activados en cultivos primarios de tumores PI. Por otra parte se demostró que in vivo la terapia con oligonucleótidos antisentido de RP fue capaz de inducir una inhibición del crecimiento tumoral. Los tumores de animales tratados mostraron una significativa reducción de células en fase proliferativa y en la expresión de RP. Se observó incremento de apoptosis sólo en un tumor en el cual el tratamiento indujo reducción de tamaño. Para evaluar la expresión del bFGF y los receptores (RFGF 1 al 4) en los tumores PD y PI procedimos a evaluar primero su expresión en distintos estadios del desarrollo de glándulas mamarias normales por inmunohistoquímica. Si bien la expresión de bFGF en la mama normal de ratón ya estaba reportada, nuestros estudios revelaron una regulación de la expresión en el desarrollo. Los 4 receptores también se expresan en las mamas normales y su expresión también está regulada en los distintos estadíos del desarrollo. Por inmunohistoquímica o inmunofluorescencia no se detectaron diferencias evaluables de expresión de bFGF o de sus receptores entre tumores PD y PI-R; si bien se pudo determinar la marcación de bFGF predominantemente estromal y la de los receptores en el parénquima tumoral. Los RFGF 2 y 3 están ampliamente expresados con localización nuclear además de la convencional. Debido a que con la técnica inmunohistoquímica no se puede discriminar entre las distintas isoformas de bFGF, se hicieron estudios de Western blots para identificar la isofonna clásica de 16kDa. Se detectó una mayor expresión de esta isoforma cuando los tumores PD crecían en ausencia de progestágenos. Para poder evaluar mejor la contribución de las células epiteliales o los fibroblastos en la expresión de bFGF, separamos ambas poblaciones y se hicieron cultivos primarios. Observamos mayor expresión de bFGF en los fibroblastos estromales de tumores PI que en los de tumores PD. En su conjunto estos datos indicarían que el bFGF estromal podría contribuir a inducir la proliferación celular en tumores PI a través de la activación de RP. En co-cultivos de células epiteliales obtenidas de un tumor PD con fibroblastos estromales obtenidos de un tumor PD o de uno PI se demostró que ambos fibroblastos ejercían un efecto sinérgico de la proliferación celular y que este efecto era mayor con los fibroblastos PI. A la inversa, células epiteliales PI cultivadas con fibroblastos PD crecieron más lentamente que al cultivarlas con fibroblastos PI. En el primer capitlo concluímos que los tumores con fenotipo PD y los PI-R necesitan de un RP funcional para proliferar y que el estroma cumple una participación activa en el crecimiento tumoral. En el crecimiento PI-R, el bFGF junto con otros factores provenientes del estroma podría estar activando los RP presentes en el parénquima, contribuyendo al fenotipo PI. El estroma PI liberaría una mayor cantidad de factores en respuesta a señales del parénquima. En el segundo capítulo estudiamos la participación del RE en el crecimiento tumoral PD y para ello bloqueamos el REα con un antiestrógeno puro, el ICI 182.780 y oligonucleótidos antisentido de REα. Como resultado, en ambos casos obtuvimos una inhibición de la proliferación celular acompañada por una disminución de expresión de RP, sugiriendo que el REα participa en el crecimiento PD y que la alta expresión de RP pueda deberse a la presencia de RE activados. En el tercer y último capítulo estudiamos el efecto de dos SERMs, y del antiestrógeno puro ICI 182.780, utilizados en la clínica sobre el crecimiento de un tumor PD y sobre la síntesis de RP. El ICI 182.780, el tamoxifeno y el raloxifeno mostraron efectos inhibitorios per se en el crecimiento in vitro al igual que el 17-β—estradiol (E2) pero en mayores concentraciones. El raloxifeno indujo una estimulación de la proliferación en presencia de progestágenos. EI ICI 182.780 y el raloxifeno revirtieron el efecto inhibitorio del E2 mientras que el tamoxifeno fue inhibitorio. El ICI 182.780 disminuyó la síntesis de RP mientras que el tamoxifeno y el E2 los aumentaron y el raloxifeno no tuvo efectos significativos. Concluimos que el tamoxifeno tiene un efecto similar al observado en la clínica en nuestro modelo experimental inhibiendo el crecimiento tumoral y aumentando la expresión de RP. Estos resultados nos llevan a hipotetizar que el tamoxifeno pueda ejercer efectos inhibitorios por su efecto estrogénico leve más que por su acción antiestrogénica. En conjunto estos resultados: a) jerarquizan el rol del receptor de progesterona en el crecimiento de carcinomas mamarios, b) brindan al estroma un posible rol protagónico en la adquisición de la hormono-independencia y c) la similitud entre los efectos del tamoxifeno obtenidos en la clínica y en estos tumores son interesantes para validar aún más los dos ítems anteriores en cuanto a su relevancia clínica.

Abstract:
In this Thesis work we have tested the following hypothesis: 1. Progesterone receptors (PR) are involved in progestin-independent (PI) tumor growth. 2. Proliferative pathways activated by growth factors activate PR. 3. Tumor stromal factors activate PR and participate in the transition to hormone-independency. 4. Estrogen receptors alpha (ERα) are involved in progestin-dependent (PD) tumor growth. All experiments were carried out in an experimental model in which the continuous administration of medroxyprogesterone acetate (MPA) to virgin BALB/c female mice induces mammary carcinomas. The tumors are metastatic ductal carcinomas expressing high levels of PR and ER showing a hormone-dependent growth pattern in syngeneic passages, since they only grow in the presence of MPA. In successive passages the tumors may acquire a progestin-independent phenotype and they can grow in the absence of MPA, even though they retain ER and PR levels. In a recent work of our laboratory (Helguera et al Breast Cancer Research and Treatment 79: 379-390, 2003) we classified PI tumors in responsive (PI-R) and unresponsive (PI-UR) based on their capacity to regress with antiprogestin treatment. In order to evaluate the ability of growth factors to mimic the stimulatory effect of progestins on cell proliferation, primary cultures of the PD tumor line (CC4-HD), were used. Cells were incubated with either MPA or bFGF and PR expression was blocked using antiprogestins or antisense oligonucleotides. Both treatments were able to reduce significantly ³H-thymidine uptake and cell number suggesting that PR are mediating bFGF induced cell proliferation. Using primary cultures from three different PI tumors: 59-2-HI, C7-2-HI and CC4-HI we were also able to demonstrate that antiprogestins and antisense oligonucleotides were able to inhibit cell growth. Specificity of antisense treatment was assessed using unrelated cells and using scrambled oligonucleotides. The elfectiveness was assessed by Western blots and by binding techniques. Mobility Gel Shift studies confirmed that both MPA and bFGF can induce PR activation in PD cells and that PR are constitutively activated in primary cultures of PI tumors. On the other hand, these in vitro studies were supported by in vivo assays in which we demonstrated that antisense therapy using phosphorothioated oligonucleotides inhibited tumor growth. Tumors from antisense-treated animals showed a significant reduction of proliferating cells and PR expression, while no differences were found when comparing tumors from scrambled- treated or control mice. We next wanted to explore the expression of bFGF and its receptors (FGFR 1 to 4) in PD and PI tumors and in different developmental stages of normal mammary glands. The presence and distribution of bFGF in normal murine mammary gland has already been described, but no studies regarding its expression in different developmental stages have been acknowledged. The four receptors were present in normal mammary glands and their expression, as bFGF, were also regulated in the different developmental stages. Immunofluorescence and immunohistochemical studies did not reveal any significant differences in bFGF and FGFR expression between PD and PI tumors; although we could determine a basically stromal and parenchymal staining for bFGF and FGFR respectively. FGFR-2 and FGFR-3 were expressed in the nuclei of parenchymal cells in addition to the reported conventional localization. Immunohistochemical studies could not distinguish between the different bFGF isoforms so Western blot assays were used to determine the expression of the classical bFGF isoform of 16 kDa. This isoform was highly expressed in tumors from untreated as compared to MPA-treated mice. As bFGF was more expressed in stroma than in the parenchyma of both PD and PI tumors and to further evaluate the contribution of epithelial or fibroblastic cells to bFGF expression, we separated both populations obtaining tumor epithelial or fibroblastic enriched primary cultures. An impressive increase in bFGF expression was observed in stromal fibroblasts from PI tumors as compared to those of PD tumors. On the other hand, epithelial PD cells co-cultivated with fibroblastic PD cells or with Pl fibroblasts showed that both fibroblastic populations had a synergic effect on cell proliferation but this effect was greater when epithelial PD cells were co cultured together with PI fibroblasts. These data altogether indicate that stromal bFGF could contribute to activate cell proliferation in PI tumors through PR activation. In the first chapter we concluded that PD and PI-R tumors need a functional PR in order to proliferate and that the stroma has an active role in tumor growth. In Pl-R tumor growth, bFGF and other factors coming from the stroma could be activating PRs present in tumor parenchyma, contributing to the PI phenotype. In the second chapter we studied the role of ER in PD tumor growth. We blocked ERα with a pure antiestrogen (ICI 182.780) and antisense oligonucleotides to ERα. As a result, in both cases cell proliferation was inhibited and this was associated to a decrease in PR expression, suggesting that ERα participates in PD tumor growth and that the high levels of PR expression may be due to constitutive ER activation. In the last chapter, we studied the effects of two SERMs and a pure antiestrogen (ICI 182.780) commonly used in clinical studies, on PD tumor growth and on PR synthesis. ICI 182.780, tamoxifen and raloxifene disclosed inhibitory effects per se in in vitro cell proliferation as 17-β-estradiol (E2) although at higher concentrations. Raloxifene stimulated cell proliferation in the presence of MPA. ICl 182.780 and raloxifene reversed E2 inhibitory effect whereas tamoxifen was inhibitory. ICI 182.780 reduced PR expression while tamoxifen and E2 increased them and raloxifene had no significant effect. We conclude that tamoxifen has a similar effect to that observed in the clinic in our experimental model inhibiting tumor growth and increasing PR expression. These results led us to hypothesize that tamoxifen can exert its inhibitory effects as a result of small estrogenic effects and not because of its antiestrogenic action. Altogether our results: a) underline the role of PRs in the growth of mammary carcinomas, b) highlight the role of stromal factors in the acquisition of hormone-independence and c) the similarity between the effects of tamoxifen obtained in the clinic and in our tumors validate even further our experimental model of breast cancer highlighting the clinical relevance of the two items described above.

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Registro:
Título : Mecanismos involucrados en la adquisición de la hormono-independncia : interacción entre receptores de progesterona y otras vías de señalización    
Autor : Lamb, Caroline A.
Director : Lanari, Claudia L.M.
Año : 2003
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Instituto de Biología y Medicina Experimental (IBYME). Laboratorio de Carcinogénesis Hormonal
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3612_Lamb
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Endocrinología
Biología / Fisiología Animal
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