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Ver el documento (formato PDF)   Marzocca, Marina Patricia.  "Caracterización de antígenos recombinantes de la glicoproteína E2 del virus de la diarrea viral bovina y su utilización como vacunas y reactivos de diagnóstico"  (2003)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
El Virus de la Diarrea Viral Bovina (BVDV) pertenece al género Pestivirus de la familia Flaviviridae y es causante de importantes pérdidas económicas en la industria ganadera regional y mundial. Las manifestaciones clinicas de la infección son variadas y las pérdidas en la producción ganadera se deben principalmente a la disminución en la producción de leche, retraso en el crecimiento, aumento de infecciones secundarias y aumento de la mortalidad en animales jóvenes. El control epidemiológico de BVDV se realiza a través de programas de vacunación masiva y eliminación de animales persistentemente infectados, principales diseminadores del virus en los rebaños. Los bajos títulos virales obtenidos en cultivo de tejidos constituyen una dificultad importante en la elaboración industrial de vacunas inactivadas. La utilización de cepas atenuadas como vacunas anti BVDV es, por otra parte, un riesgo mayor ya que la aparición de revertantes en un animal pre-infectado con BVDV podría desencadenar la “enfermedad de las mucosas”, que es fatal y en vacas preñadas podría dar origen a una camada de terneros persistentemente infectados. El diagnóstico de las infecciones con BVDV, realizada a través de la detección de anticuerpos en suero bovino por seroneutralización y/o inmunoensayo enzimática (ELISA) también presenta dificultades debidas, entre otras, a la necesidad de contar con infraestructuras adecuadas para el cultivo de células y a los desafios técnicos que presenta la obtención de antígeno purificado. En este trabajo se expresó en sistemas recombinantes y se caracterizó bioquímica e inmunológicamente al principal inmunógeno de BVDV, la glicoproteína E2. La proteína fue expresada en células de mamífero y de insecto, en su forma entera (rE2) y delecionada en su extremo carboxilo terminal de anclaje a membrana (ΔrE2) y se ensayó su desempeño como vacuna y como antígeno para diagnóstico. La proteína recombinante E2 (rE2) presento características electroforéticas e inmunoquímicas idénticas a la E2 viral y resultó ser un potente inmunógeno en bovinos. La incorporación del gen de rE2 en el genoma de un Virus de la estomatitis vesicular (VSV) recombinante permitió, también , la creación de un virus atenuado de VSV (VSV-E2) capaz de inducir una excelente respuesta humoral anti BVDV en ratones y óptima producción de E2 recombinante en células de BHK en cultivo. En este trabajo también se demostró que la proteína ΔrE2 es expresada y liberada al sobrenadante del cultivo de células de Drosophila melanogaster lo que permitió contar con una preparación rápida y relativamente pura de antígeno. Este fue utilizado en un test de ELISA de captura (a través de un anticuerpo monoclonal anti rE2, también desarrollado en el curso de este trabajo de Tesis) que presenta alta sensibilidad y especificidad para la detección de anticuerpos anti BVDV en sueros bovinos.

Abstract:
The Bovine Viral Diarrhea Virus (BVDV) belongs to the genus Pestivirus of the family Flaviviridae and is responsible for important economic losses in the cattle industry throughout the world. The clinical manifestations of the infection are varied and the looses in the cattle production are mainly due to the decreased production of milk, delay in the growth, increase of secondary infections and increase of the mortally in young animals. Control of BVDV is carried through programs of massive vaccination and elimination of persistently-infected animals that are the main source of contagious virus in the field. Deficient virus production in cell culture constitutes an important difficulty in the industrial elaboration of inactivated vaccines. The use of attenuated viruses as BVDV immunogens on the other hand, is risky since revertants could produce mucosal disease in preinfected animals. This is eventually fatal and, in the case of pregnant cows, could give origin to persistently infected calves. The diagnosis of BVDV infections is accomplish by detection of specific antibodies in bovine serum in seroneutralization and/or enzyme linked immuno (ELISA) assays. These techniques also present difficulties related, for instance, to the necessity of having appropiate infrastructures for cell culture and obtaining purified antigen in workable amounts, as well. In this work the main immunogenic protein of BVDV, the glycoprotein E2, was expressed in different recombinant systems and characterized, subsequently , biochemically and immunologically. The protein was expressed in mammalian and in insect cells either as a whole protein (rE2) or as a deleted form lacking its carboxi terminal membrane anchor (ΔrE2) and its potential as immunogen and as a diagnostic antigen was explored. The recombinant protein E2 (rE2) showed electrophoretic and immunochemical characteristics identical to those of its viral counterpart and also induced a potent anti BVDV serum response in bovines when administerd in an oil emulsion. Incorporation of the rE2 gene in a recombinant Vesicular stomatitis virus (VSV) genome allowed us, in addition, to generate an attenuated virus of VSV (VSV-E2) able to induce an excellent humoral anti-BVDV response in mice and to produce recombinant E2 in infected BHK cell cultures. The protein ΔrE2 is expressed and released to the extracellular medium of transformed Drosophila melanogaster cells expressing the recombinant protein, in what turned to be a quick and simple way to get relatively pure and soluble antigen. This allowed the design of an ELISA test using soluble rE2 as antigen and a specific anti E2 capture MAb (developed during this Thesis work using rE2 expressed by baculovirus) that presents high sensibility and specificity for the detection of anti BVDV antibodies in bovine sera.

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Registro:
Título : Caracterización de antígenos recombinantes de la glicoproteína E2 del virus de la diarrea viral bovina y su utilización como vacunas y reactivos de diagnóstico    
Autor : Marzocca, Marina Patricia
Director : La Torre, José Leonardo
Director Asistente : Grigera, Pablo Rafael
Año : 2003
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Centro de Virología Animal (CEVAN)
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3615_Marzocca
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Virología
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