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Ver el documento (formato PDF)   Martinez Montaño, Romari Alejandra.  "Biomarcadores de genotoxicidad en el estudio de la fragilidad genómica en el orden primates"  (2003)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
Existe cada vez más evidencia a favor de la hipótesis de que la inestabilidad genómica estaría directamente relacionada con la estructura de ciertos loci específicos involucrados en rearreglos cromosómicos recurrentes, conocidos como “puntos calientes". Con la finalidad de establecer si es posible detectar estos “puntos calientes” a nivel citogenético, la presente Tesis Doctoral emplea biomarcadores de genotoxicidad como manifestación de fragilidad cromosómica inducida por agentes químicos. Para ello, se trabajó con dos modelos: Cebus apella (CAP) y Homo sapiens (HSA), un sistema experimental como los linfocitos de sangre periférica (LSP) y un agente químico inductor como el metronidazol (MTZ). Cebus apella (CAP) es un Primate del Nuevo Mundo, ampliamente utilizado como modelo experimental en diferentes áreas de la biomedicina que, hasta el presente, poco había sido analizado en cuanto a su utilidad en estudios de genotoxicidad empleando agentes químicos. El Metronidazol (MTZ) es un derivado 5-nitroimidazólico considerado un agente genotóxico en sistemas in vivo e in vitro. En el presente trabajo de Tesis Doctoral, se utilizaron distintas concentraciones de MTZ en cultivos de linfocitos de sangre periférica (LSP) de Cebus apella y de humanos (HSA), con la finalidad de evaluar su potencial mutagénico sobre los genomas de ambas especies, por separado y a nivel intergenómico, realizando un análisis de las frecuencias de ICH y ACG a nivel de banda cromosómica, utilizando una técnica de Bandas G (Tinción Wright)-ICH secuencial puesta a punto en el marco de esta Tesis. Los resultados se analizaron en un nivel genómico general, para los cuatro biomarcadores empleados (Índice Mitótico —IM-, Índice de Replicacíón —IR-, Intercambio de Cromátides Hermanas —ICH- y Aberraciones Cromosómicas Incluyendo Gaps. —ACG-), empleando un diseño en bloques al azar (DBA) y un ANOVA de dos vías para CAP y para HSA. A nivel genómico sitio específico, se analizaron las frecuencias para dos biomarcadores (ICH y ACG) por cromosoma, brazo y banda cromosómica, utilizando una Chi cuadrado, considerando siempre como frecuencia esperada la correspondiente al control de diseño (sin el agregado de droga). A nivel intergenómico se utilizó la prueba U-Mann Whitney para el análisis de las frecuencias medias entre CAP y HSA. Se realizó una tabla de 41 puntos de homeología, según la literatura, que se completó con la información de las frecuencias de ICH y de ACG en dichos puntos para CAP y HSA realizando el análisis mediante el coeficiente de Spearman. El MTZ genera una disminución del IM y un aumento de los ICH por célula y las ACG por célula en cultivos de LSP de Cebus apella y de Homo sapiens, con respecto al control de diseño. Para ambas especies, el IR no se ve afectado por la presencia de MTZ en las concentraciones utilizadas en el presente estudio. Los promedios generales para los cuatro biomarcadores no mostraron diferencias estadísticamente significativas entre CAP y HSA. Este hallazgo es coherente con una conservación genómica de más del 80%. La ausencia de relación entre los ICH y las ACG por cromosoma y el tamaño o la morfología cromosómicos, junto a una concentración de ambos biomarcadores en un conjunto de bandas, indicaría la no aleatoriedad en la distribución de la fragilidad genómica, junto a una conservación de la información en los segmentos homeólogos entre ambos genomas. Encontramos bandas con elevadas frecuencias de ICH y/o ACG en todos los casos, es decir, puntos con una elevada “inestabilidad genómica basal”, y bandas con bajas o nulas frecuencias (de ICH y/o ACG) para el control de diseño, con diferencias estadísticamente significativas al agregar MTZ al cultivo. La mayoría de estas bandas contienen secuencias que han sido calificadas como indicadoras de inestabilidad genómica, o son consideradas Sitios Frágiles. Los hallazgos del presente trabajo representarían evidencias citogenéticas de la no aleatoriedad en la distribución de la fragilidad genómica en Primates, y de su conservación a nivel evolutivo.

Abstract:
There is increasing evidence supporting the hypothesis that chromosomal instability might be related to the structure of certain loci, involved in recurrent chromosomal rearangements. These sites are currently known as “hot spots”. With the goal of detecting these “hot spots” at a cytogenetic level, two models have been used: Cebus apella (CAP) and Homo sapiens (HSA), with an experimental system such as Peripheral Blood Lymphocytes (PBL) and a chemical inducer, such as metronidazole (MTZ), using genotoxicity biomarkers as an expression of chemically induced chromosomal fragility. Cebus apella (CAP) is a New World Primate, extensively used as an animal model in biomedicine. Up to now, its usefulness in genotoxic studies with chemical agents has been scarcely evaluated. Metronidazole (MTZ) is a 5-nitroimidazole derivative considered potentially genotoxic in several systems, both in vivo and in vitro. In this PhD Thesis, different concentrations of MTZ were added to PBL cultures of Cebus apella and HSA, with the aim of assessing, through genotoxicity markers, the effect of a potentially mutagenic agent in vitro on both genomes, separately and combined in an intergenomic analysis, performing an evaluation of the frequency of Sister Chromatid Exchanges (SCE) and Chromosomal Aberrations including Gaps (CAG) per band, using a sequential G(Wright stain)/SCE technique, developed for this Thesis. Results are analyzed at two levels: a) general, considering the four biomarkers measured (Mitotic Index, MI, Replication Index, RI, SCE and CAG), using a randomized block desing (RBD) and a Two-way ANOVA, and b) site-specific, for SCE and CAG frequencies, measured at each chromosome, chromosomal arm and band, with a Chi Square test, using always as the expected frequency the desing control (no MTZ added). At an intergenomic level, a U-Mann Whitney Test was used to compare all average values for the four biomarkers; a Table of 41 homeology regions was constructed following published references, and completed with the information for SCE and CAG for each point in CAP and HSA. Each homeolog pair was analyzed with a Spearman Coefficient. MTZ generates a decrease in MI and an increase , in SCE and CAG frequencies per cell in PBL cultures of Cebus apella and HSA (compared to the desing control). RI is not affected by the presence of MTZ in both species. General averages for the four biomarkers cannot be differentiated statistically between CAP and HSA. This is coherent with a genomic conservation of more than 80%. The lack of relationship between chromosomal length, size or morphology, along with a concentration of relatively high frequencies of SCE and CAG in a few chromosomal bands, can be considered indicators of a non random distribution of chromosomal fragility, along with the evolutionary conservation of homeolog segments between both genomes. We find bands with a high basal frequency of SCE and/or CAG in all cases, which represent regions of “basal genomic instability”, and bands with zero or low frequency of SCE and/or CAG in control cultures, showing a statistically significant increase of their frequencies in cultures exposed to MTZ. Most of these bands contain sequences that have been pointed as indicators of genomic instability, or are Fragile Sites. The current findings represent cytogenetic evidence of a non random distribution of chromosomal fragility in Primates, related to evolutionary conservation.

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Registro:
Título : Biomarcadores de genotoxicidad en el estudio de la fragilidad genómica en el orden primates     =    Genotoxicity biomarkers in the analysis of genomic fragility in primates
Autor : Martinez Montaño, Romari Alejandra
Director : Mudry, Marta Dolores
Director Asistente : Carballo, Marta Ana
Año : 2003
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Ecología, Genética y Evolución. Grupo de Investigación en Biología Evolutiva (GIBE)
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3620_MartinezMontano
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Evolución
Biología / Genética
Palabras claves : CEBUS APELLA; HOMO SAPIENS; FRAGILIDAD GENOMICA; GENOTOXICIDAD; CITOGENETICA; HOMEOLOGIAS; PUNTOS CALIENTES; BIOMARCADORES; METRONIDAZOL; CEBUS APELLA; HOMO SAPIENS; GENOMIC FRAGILITY; GENOTOXICITY; BIOMARKERS; METRONIDAZOLE; CYTOGENETICS; CROMOSOMAL HOMEOLOGIES; HOT SPOTS
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