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Ver el documento (formato PDF)   Goutman, Juan D..  "Caracterización farmacológica y biofísica de los receptores ionotrópicos de Gaba"  (2003)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
El ácido γ-aminobutírico (GABA) es el principal neurotransmisor inhibitorio del sistema nervioso central de vertebrados y hasta el momento se han caracterizado tres tipos de receptores de GABA, según sus propiedades farmacológicas: GABAa, GABAb y GABAc. Los receptores de GABAa (GABAaR) y GABAc (GABAcR) comparten además su mecanismo de señalización, ambos son receptores ionotrópicos con una alta permeabilidad a iones cloruro. Los receptores de GABAb son metabotrópicos, generalmente acopladas a proteínas G. En esta tesis se presenta una extensa caracterización de las propiedades farmacológicas y biofísicas de los receptores de GABA, con especial énfasis en los GABAcR Este subtipo de receptores de GABA fue el último en ser identificado y se caracteriza por su insensibilidad al antagonista clásico GABAérgico, bicuculina y por el lento curso temporal de sus respuestas. Este trabajo se realizó expresando los receptores en ovocitos de Xenopus laevis y estudiando sus propiedades con dos diferentes técnicas electrofisiológicas: fijación de voltaje con dos electrodos (FVDE) y patchclamp en la configuración outside out. Los receptores ionotrópicos de GABA (GABA-R) son modulables por una diversidad de compuestos de diferente naturaleza química. Entre ellos se encuentran los flavonoides (F), una familia de compuestos aislados de plantas vasculares que presentan una gran variedad de acciones neurofarmacológicas. Algunos son ansiolíticos y sedantes, y se ha propuesto que su mecanismo de acción sería a través de los GABAaR. En este trabajo, evaluamos la acción de un grupo de F sobre las respuestas mediadas por GABA-R. Los F utilizados en este trabajo fueron: quercetina, crísina, apígenina, morina, flavona y α-naftoflavona. Contra lo esperado, los F evaludados tuvieron un efecto inhibitorio general tanto sobre los GABAaR como los GABAcR. Quercetina fue el más potente para ambos receptores con un IC50 de aproximadamente 4 µM en cada caso. También se evaluó la acción de quercetina en otros receptores ionotrópicos de neurotransmisores, como los colinérgicos nicotínicos, serotonina y kainato. En todos ellos se observaron efectos inhibitorios con distinta potencia. Tanto los GABAaR como los GABAcR son sensibles al alcaloide picrotoxina. Se han propuesto distintos mecanismos para su acción sobre los GABAaR incluyendo efectos no-competitivos y mixtos. Sin embargo, aún no se ha esclarecido suficientemente el mecanismo de acción en los GABAcR. Picrotoxina produjo una inhibición reversible con un IC50 = 0.6 ǂ 0.1 µM. La curva dosis-respuesta (D-R) para GABA en presencia del antagonista (1, 10 y 100 µM) sufrió un desplazamiento hacia la derecha y para las concentraciones más altas de esta toxina, una reducción en la respuesta máxima. Este resultado sugeriría un mecanismo de acción de tipo no-competitivo. No obstante, al igual que los antagonistas competitivos, las respuestas a concentraciones bajas de GABA fueron más sensibles a picrotoxina que las más altas. La inhibición por esta toxina fue también dependiente del uso, es decir, requirió la activación de los receptores para ejercer su efecto. La recuperación de la inhibición también fue facilitada por la acción de GABA. Además, picrotoxina produjo un aumento en la velocidad de de-activación de las respuestas al GABA, sugiriendo un mecanismo de tipo no-competitivo. En resumen, la inhibición de los GABAcR por picrotoxina tendría un mecanismo de acción no-competitivo o mixto, y dependiente del uso aunque menos que los GABAaR. Los GABAcR son sensibles a la modulación por iones trivalentes de la serie de los lantánidos (L) que producen un incremento en las respuestas a GABA. En un estudio previo se caracterizó la acción de uno de los elementos pertenecientes a los L, lantano (La³+); mientras que en este trabajo se analizaron los efectos de otro, lutecio (Lu³+). Ya en experimentos preliminares, se observó que la acción de Lu³+ sería más compleja ya que produjo un aumento rápido de la corriente, seguido de una atenuación durante la aplicación del ión sobre la respuesta a GABA. Lu³+ provocó una aumento en la afinidad aparente por GABA (0.4 ǂ 0.1 µM) y un incremento en la respuesta máxima a concentraciones saturantes de agonista. También se evaluó cómo afectaba la presencia de Lu³+ a la acción de ciertos antagonistas, como parámetro de la función de los GABAcR. El antagonista competitivo, TPMPA, inhibió las respuestas evocadas por GABA en presencia de Lu³+ con una potencia semejante a lo observado en ausencia de este ión. No obstante, no tuvo un efecto protector de la atenuación de la respuesta mediada por Lu³+, sugiriendo que este proceso sería operado por este ión independientemente de GABA. Las respuestas evocadas en presencia de Lu³+ también fueron sensibles a picrotoxina pero con caracteristicas diferentes a lo ya descripto. Se elaboró, además, un modelo de gating de los GABAcR y de la acción de Lu³+, donde se propone la existencia de dos estados abiertos, revelado por la presencia de este ión, que además mediaría un proceso de desensibilización independiente de GABA. Los estudios existentes sobre la cinética de los GABAcR fueron hechos con técnicas de pobre resolución temporal, y por esto decidimos realizar esta serie de experimentos en parches de membrana con la técnica de patch-clamp en la configuración outside out. Las respuestas al GABA obtenidas con esta metodología presentaron un curso temporal característico de los GABAcR: activación y de-activación lentas, de varios segundos de duración, con escasa desensibilización. La afinidad aparente por GABA calculada fue 4.0 ǂ 0.8 µM con un n de Hill = l.7 ǂ 0.5. La relación corriente-voltaje fue lineal, y el canal mostró una permeabilidad alta a cloruro. Se evaluó la sensiblidad de los GABAcR en parches de membrana a una serie de agonistas (TACA, β-alanina, glicina), antagonistas (TPMPA, picrotoxina, quercetina, zinc) y moduladores (La³+ y Lu³+) conocidos. Todos estos produjeron efectos similares al descripto previamente. Un estudio más profundo de la cinética de de-activación de las respuestas mostró que a concentraciones altas de agonista, la relajación era mejor descripta por ecuación de decaimiento exponencial de segundo orden; mientras a dosis cercanas al EC50,de primer orden. Esto sugeriría un modelo de gating con dos estados abiertos con distinta cantidad de moléculas de agonista unido, que fue evaluado realizando simulaciones numéricas de la actividad del receptor.

Abstract:
γ-arninobutyric acid (GABA) is the main inhibitory neurotransmitter in vertebrate central nervous system. Three GABA receptors subtypes have been described according to their pharmacological properties: GABAa, GABAb, and GABAc. GABAa (GABAaR) and GABAc (GABAcR) receptors also share their signaling mechanism, they are both ionotropic receptors with high chloride permeability. GABAb receptors are metabotropic and commonly coupled to G protein. In this thesis, we show an extent pharmacological and biophysical description of GABA receptors with special interest in GABAcR. This is the more recently identified GABA receptor and characterizes by its resistance to the classic GABAergic antagonist, bicuculine, and its slow time-course responses. Receptors were studied in this work by means of the expression in Xenopus laevis oocytes and two different electrophysiological techniques: two electrode voltage clamp (TEVC) and patch-clamp in outside out configuration. Ionotropic GABA receptors (GABA-R) can be modulated by a variety of compounds with different chemical structure. Flavonoids (F) are a group of compounds isolated from vascular plant that show distinct neuropharmacological effects. Some of them are anxiolytic and sedative, and a mechanism mediated by GABA receptors has been suggested. In this study, we have evaluated the effects of a group of F on GABA receptors function. The F tested were: quercetin, chrisin, apigenin, morin, flavone and α-naphtoflavone. Unexpectedly, these F showed an overall inhibitory effects on GABAaR and GABAcR. Quercetin was the most potent antagonist on both types of receptors with an IC50 value of approximately 4 µM. The actions of quercetin on other ionotropic neurotransmitter receptors, like cholinergic nicotinic, serotonin and kainate, were also tested. Different degrees of inhibition were observed in all of them. Both GABAaR and GABAcR can be blocked by the alkaloid picrotoxin. Different mechanisms of action have been proposed for the inhibition of this antagonist on GABAaR, including non-competitive and mix effects. However, the exact mechanism of action for GABAcR has not been clarified yet. Picrotoxin produced a reversible inhibition on GABAcR with an IC50 = 0.6 ǂ 0.1 µM. Dose-responses (D-R) curves in the presence of this antagonist (1, 10 and 100 µM) were right-shifted and an insumountable blockage was seen for high concentrations of toxin. All these suggest a non-competitive mechanism of action. However, as described for competitive antagonists, inhibition was more profound with low agonist concentrations than higher. Picrotoxin action was also use-dependent, i.e., receptor activation was required to exert its effect. Antagonist wash out was also facilitated by GABA action. In addition, picrotoxin produced an increase in de-activation rate of GABA-evoked responses, suggesting a non competitive effect. In summary, GABAcR inhibition by picrotoxin would present a non-competitive or mix mechanism of action, and also use-dependent effect, but in a lower degree than GABAaR. GABAcR can be modulated by trivalent cations from lanthanides (L) series that produce an increase in GABA evoked responses. The actions of lanthanum (La³+), one of the L, on GABAcR have been characterized in a previous study, and here we have analyzed the effects of other L, lutetium (Lu³+). In preliminary experiments, Lu³+ showed more complex actions, with a fast increase in GABA-evoked current, followed by attenuation during ion application. An increase in apparent affinity for GABA (0.4 ǂ 0.1 µM) and also in maximal efficacy was observed in the presence of Lu³+. The inhibition of some antagonists was evaluated in the presence of Lu³+ as a parameter for GABAcR function. TPMPA, a competitive antagonist, inhibited the action of GABA and Lu³+ with a potency similar to that was observed in the absence of this ion. However, Lu³+ mediated current attenuation was not protected by this antagonist, suggesting that this process would be operated by this modulator independently of GABA. GABA-evoked responses in the presence of Lu³+ could also be inhibited by picrotoxin but with a different profile than was previously described. In addition, a model for GABAcR gating and Lu³+ actions has been elaborated, in which two open states were proposed based on this ion effect, that would also mediate a desensitization process independent of GABA. Currently available studies on GABAcR kinetics have been carried out with techniques devoid of a proper time resolution. This is why we decided to perform experiments on membrane patches with the patch-clamp technique in outside out configuration. GABA-evoked responses showed typical GABAcR characteristics when obtained with this methodology: slow activation and de-activation kinetics, and poor desensitization even at high agonist concentrations. An apparent affinity for GABA of 4.0 ǂ 0.8 µM was calculated with a Hill coefficient = 1.7 ǂ 0.5. Current-voltage relation was lineal, and the channel was highly permeable to chloride. GABAcR present in membranes patches were tested with distinct already-known agonists (TACA, β-alanine, glycine), antagonists (TPMPA, picrotoxin, quercetin, zinc) and modulators (La³+ and Lu³+). They all showed similar effects to what was already described. An extensive study on de-activation kinetics of GABA-evoked currents showed that relaxation at high concentrations was better fit by a second order exponential decay equation, while at EC50 doses a first order was used. This would suggest a gating model with two open states with distinct number of agonist bound molecules, that was evaluated by numerical simulations of receptors function.

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Registro:
Título : Caracterización farmacológica y biofísica de los receptores ionotrópicos de Gaba    
Autor : Goutman, Juan D.
Director : Calvo, Daniel J.
Año : 2003
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular (INGEBI)
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3635_Goutman
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Neurociencias
Biología / Biología Molecular y Celular
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