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Ver el documento (formato PDF)   Fabris, Victoria T..  "Contribución de los estudios cromosómicos a la comprensión de los mecanismos de la carcinogénesis hormonal: estudio citogenético de carcinomas mamarios murinos inducidos por progestágenos"  (2003)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
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Resumen:
El tratamiento prolongado con acetato de medroxiprogesterona (MPA) en ratones de la cepa BALB/c induce carcinomas mamarios de histología ductal, que expresan receptores de estrógenos y progesterona, y son metastásicos en pulmón y ganglio linfático. Estos tumores se mantienen in vivo por pasajes singeneicos, siendo hormono-dependientes (HD) ya que requieren del agregado exógeno del MPA para crecer, y no crecen en animales sin tratar con MPA. Se seleccionaron variantes hormono-independientes (HI) a partir de los tumores HD que comenzaron a crecer en los animales sin MPA. Estos tumores HI son capaces de crecer en animales sin tratar con MPA, pero mantienen los receptores hormonales. Los tumores HI presentan una respuesta diferencial a1 tratamiento con l7-ᵝ-estradiol (E2) y los antiprogestágenos mifepristona y onapristona. Se los clasifica en respondedores, aquellos tumores HI que inhiben su crecimiento in vivo por el tratamiento hormonal, y no respondedores a aquellos que no regresionan por el tratamiento. En la primera parte de este trabajo se estudió el cariotipo de los tumores HD (n=5) y sus variantes HI (n=ll) con técnicas de citogenética clásica (bandeo G) y molecular (hibridación in situ fluorescente, FISH), con el objetivo de relacionar el número de cromosomas y las alteraciones del cariotipo presentes con las características biológicas de los tumores. Tres de los 5 tumores HD (60%) presentaron un número de cromosomas en el rango diploide (ratón normal, 2n=40), mientras que los tumores HD que presentaron números modales en el rango triploide a tetraploide fueron estudiados en pasajes muy avanzados. Los tumores HI en pasajes tempranos presentaron números modales diploides. En pasajes tardíos la mayoría de los tumores HI (8 de los ll estudiados) presentaron cariotipos en el rango triploide a tetraploide. Todos los tumores presentaron alteraciones numéricas y estructurales de sus cromosomas. No se observó una alteración común a todos los tumores, o que estuviera asociada con la dependencia hormonal. Sin embargo, podemos inferir que los tumores con números modales diploides responderán al tratamiento con E2 y antiprogestágenos. Las alteraciones más frecuentes fueron ganancia de los cromosomas 3, 4 y 6 (entre el 50% y 60% de los tumores) y pérdida de los cromosomas 16 y X (en el 70% y 100% de los tumores, respectivamente). En un análisis global, la pérdida del cromosoma X resultó significativa. Se observaron numerosas translocaciones, que involucraron a los cromosomas 4 y 7 con mayor frecuencia (presentes en tres de las cuatro familias tumorales con alteraciones evaluables), observándose el mismo punto de ruptura para el cromosoma 7. Por otra parte, las alteraciones presentes en los tumores HD se conservan en los pasajes tempranos del crecimiento autónomo. En base a estos resultados podemos concluir que los tumores inducidos por el MPA serían diploides, y que con el continuo pasaje in vivo puede aumentar el número de cromosomas. La adquisición de la hormono-indepedencia no es causada por el aumento de la ploidía, y los tumores HI conservarían el cariotipo diploide de los tumores HD en los pasajes tempranos. El aumento del número de cromosomas y la adquisición de nuevas alteraciones sería posterior a la adquisición de la hormono-independencia y ocurriría como consecuencia del aumento de los pasajes. La ocurrencia en pasajes más tempranos de variaciones en el cariotipo observada en los tumores HI con p53 mutado, respecto de los tumores HI con p53 normal, podría estar asociada a las mutaciones en p53. Sin embargo, en el tumor HD la presencia de p53 mutado no está acompañada de inestabilidad cromosómica, sugiriendo que serían necesarios otros factores además de dichas mutaciones. En la segunda parte del trabajo se estudiaron los cambios del cariotipo durante el establecimiento de líneas celulares a partir de carcinomas mamarios murinos HD y HI. Se analizaron las variaciones en ploidía y de las alteraciones cromosómicas a lo largo de los repiques de las 8 líneas celulares obtenidas. Las líneas celulares conservaron el número de cromosomas diploide de los tumores parentales en los primeros repiques, este número de cromosomas aumentó con los posteriores pasajes in vitro, y se estabilizó en el rango triploide en 5 de las 8 líneas celulares, sugiriendo que éste les daría cierta ventaja para el crecimiento en cultivo. Sin embargo, una de las líneas celulares mantiene su cariotipo diploide hasta repiques avanzados. Todas las líneas celulares conservan los cromosomas marcadores de los tumores parentales a través de los repiques, pero 7 de las 8 líneas adquieren alteraciones nuevas desde repiques muy tempranos. Podemos concluir que el aumento de la ploidía se vería favorecido por el avance de los repiques. Por otra parte, los cromosomas marcadores del tumor no se pierden por el continuo cultivo in vitro, pero se favorece la formación de nuevas alteraciones. El conocimiento del cariotipo permitió, además de caracterizar las líneas celulares, discernir sobre el origen de una de las líneas establecidas. En resumen, en este trabajo de tesis se investigó la evolución cariotípica de diferentes tumores mamarios murinos en su evolución desde la hormono-dependencia hacia la independencia, y de las líneas celulares derivadas. En nuestro conocimiento, este es el primer informe del estudio citogenético en relación con la independencia hormonal en tumores mamarios murinos. Los genes ubicados en los sitios de ruptura de las translocaciones observadas, como por ejemplo Aurora C, merecen ser estudiados en investigaciones futuras.

Abstract:
Medroxyprogesterone acetate treatment in BALB/c female mice leads to the development of ductal mammary carcinomas which express estrogen and progesterone receptors and are metastatic in axilar lymph nodes and lungs. They are maintained by syngeneic transplantation in progestin treated female mice disclosing a hormone dependent (HD) pattern of tumor growth. Occasionally hormone independent (HI) variants have been selected. These HI tumors are able to grow without exogenous hormone supply. Some of them are able to regress completely afier l7-ᵝ-estradiol or antiprogestin administration and are so called responsive HI tumors while others are unresponsive to both treatments. In the first part of this study we have investigated the karyotype of 5 HD tumors and of ll HI variants using classic cytogenetic techniques as G banding and molecular approaches as fluorescence in situ hybridization (FISH). The aim of this study was to evaluate possible relationships between ploidy, chromosome markers and acquisition of hormone independence. A near diploid karyotype (2n=40) was found in 3/5 HD while a triploid to tetraploid karyotype was observed in the other two HD tumors which were studied in late passages. In early passages from HI tumors we obtained diploid karyotypes while in advanced passages they were mainly poliploid (8/11 tumors). All tumors showed number and structural chromosomal rearrangements. The tumors studied did not share chromosomal abnormalities neither chromosome markers could be related to HD or HI tumors. However, it seems that in this experimental model it can be inferred that a diploid tumor will be responsive to hormones whereas a poliploid tumor may be HD, responsive HI or unresponsive to hormone treatments. The most frequent chromosomal rearrangements found in individual tumors were gains in chromosomes 3, 4 and 6 (in 50 and 60% of the tumors) and loses in chromosomes 16 and X (70% and 100% respectively). In a global analysis of frequencies only loses of chromosome X were statistically significant. Nearly all tumors disclosed several translocations (22 in 9 tumors studied). Chromosomes 4 and 7 were involved independently in 3 of the 4 tumor families which could be studied. Twice they were together, and in the case of chromosome 7, in the same breakpoint. Abnormalties present in HD tumors were maintained in early passages of HI tumors although later on new rearrangements were observed. It can be concluded that MPA dependent tumors are probably diploid and polyploidy arises by continuous in vivo transplantation. The acquisition of hormone independence is not caused by an increase in ploidy. Conversely, HI tumors may maintain the same diploid karyotype in early passages while progressively losing and acquiring new markets in later passages. SSCP revealed a point mutation in p53 in 4/5 tumors of the same family. The parental HD tumor showed a diploid stable karyotype while the HI variants were poliploid and did not share common markers suggesting that mutated p53 is not uniquely involved in chromosome instability. HI variants may have acquired other alterations that together with mutated p53 may confer this phenotype. In the second part of this study the karyotype of 8 cell lines derived from 2 of these diploid tumors was investigated. Cell lines maintained the diploid karyotype during the early passages and nearly all of them after passage 35 changed to a stable triploid karyotype. Only one cell line, the MC4-L5 remained diploid for more than 45 passages. All cell lines maintained the same chromosome markers than the parental tumors and 7/8 acquired new markers which were different for each cell line and were characterized in this study. It can be concluded that the onset of the cell lines are not defined by increases in ploidy but that in vitro culturing favors their evolution towards a triploid state. The fact that the onset of the cell lines were associated with new different rearrangements suggests that these may favor this event. Thus cytogenetic analysis is extremely important to identify cell lines. In addition, cytogenetic studies helped to determine if one of the cell lines could have been originated as a consequence of an epithelial mesenchymal transition from the same cells or if it could have been originated from a different cell. Summing up, in this thesis we have investigated the evolution of karyotypes of different mammary tumors from a hormone dependent to a hormone independent state and in their derived cell lines. To our knowledge this is the first report on the field studying cytogenetics in relation to hormone independence in mouse mammary tumors. Genes located in breakpoints, such as Aurora C in chromosome 7, deserve further investigations.

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Registro:
Título : Contribución de los estudios cromosómicos a la comprensión de los mecanismos de la carcinogénesis hormonal: estudio citogenético de carcinomas mamarios murinos inducidos por progestágenos     =    Contribution of the study of chromosomes to the understanding of the mechanisms governing hormonal carcinogenesis: cytogenetic study of murine mammary carcinomas induced by progestins
Autor : Fabris, Victoria T.
Director : Lanari, Claudia
Director Asistente : Merani, María Susana
Año : 2003
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Instituto de Biología y Medicina Experimental (IBYME). Laboratorio de Carcinogénesis Hormonal
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3658_Fabris
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Genética
Biología / Endocrinología
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