Tesis > Documento


Ver el documento (formato PDF)   Molinero, Luciana Lorena.  "Inmunobiología de MICA en linfocitos T: estímulos fisiológicos, rutas de señalización y consecuencias funcionales de su expresión"  (2004)
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
URL:
     
Resumen:
INTRODUCCIÓN: La interacción de MICA con el receptor activador de citotoxicidad NKG2D (expresado en células NK y linfocitos T Ɣδ y αβ CD8+), desencadena una respuesta citotóxica contra células que expresan MICA. MICA se induce por estímulos de estrés, infecciones, neotransformación o linfocitos T activados con fitohemaglutinina. OBJETIVOS: a) estudiar la expresión de MICA en linfocitos T activados con estímulos fisiológicos; b) investigar los mecanismos moleculares involucrados y; c) investigar las consecuencias funcionales de dicha expresión. RESULTADOS: Por Western Blot, RT-PCR y citometría de flujo se observó que MICA se induce en linfocitos T presentes en células mononucleares de sangre periférica (CMSPs) por estimulación con células alogeneicas, por microagregación del complejo TCR/CD3 o por coestimulación con la molécula CD28 y PMA. Los niveles de expresión de MICA alcanzaron una meseta a los 4-7 días post-estímulo. Empleando inhibidores farmacológicos, observamos que la expresión de MICA inducida por la microagregación del complejo TCR/CD3, o la coestimulación a través de CD28 y PMA involucran a Lck/Fyn, ERK1/2, calcineurina, p38 MAPK, p70 56 y Jak. Asimismo, la inhibición farmacológica de NF-kB bloqueó la expresión de MICA en linfocitos T activados de la misma manera. Detectamos un sitio de unión KB localizado en el primer intrón del gen de MICA, y por ensayos de supershift observamos que esta secuencia une a los dímeros p65(RelA)/p50 y p50/p50 presentes en extractos nucleares de linfocitos T activados. Asimismo, la sobreexpresión de RelA en células HeLa por transfección transitoria incrementó los niveles de MICA, confirmando que la expresión de dicho gen es regulada por NF-kB. Además, por Western Blot observamos que CMSPs estimuladas con las citoquinas mitogénicas IL-2 e IL-4, lo mismo que linfocitos T polarizados hacia un perfil Th1 o Th2 inducen la expresión de MICA. Linfocitos T CD4+ purificados y activados con PMA e Ionomicina, pero no linfocitos T CD4+ presentes en CMSPs, expresan MICA en su superficie. Por ensayos de transwell, observamos que este fenómeno se debe a un factor soluble liberado por CMSPs activadas. Además, linfocitos T CD4+ activados con PMA e Ionomicina son blancos de citotoxicidad por células NK autólogas activadas con IL-2 (LAK). El bloqueo de la interacción MICA-NKG2D con AcMo anti-MICA mostró que MICA juega un rol menor en dicha respuesta. CONCLUSIONES: MICA se induce en linfocitos T activados por estímulos fisiológicos e involucra a la señalización de Lck/Fyn, ERK1/2, calcineurina, p38 MAPK, p70 56k, Jak y al factor de transcripción NF-kB. La expresión de MICA en superficie de linfocitos T tiene un rol menor en la lisis por células NK activadas. En esta tesis se describen por primera vez algunas de las vías de transducción de señales y un factor de transcripción involucrados en la expresión de MICA. Los resultados presentados sugieren además que la interacción MICA-NKG2D podría constituir un nuevo mecanismo de regulación de la respuesta inmune adaptativa.

Abstract:
INTRODUCTION: The interaction between MICA and the cytotoxicity activating receptor NKG2D (expressed in NK cells and CD8+ αβ and Ɣδ T cells) triggers a cytotoxic response against MICA expressing cells. MICA is induced by stress stimuli, infections, neotransformation or phytohemagglutinin in T cells. OBJECTIVES: a) to study MICA expression in T cells activated with physiological stimuli, b) to investigate the molecular mechanisms involved, and c) to explore the functional consequences of that expression. RESULTS: We activated T cells present in peripheral blood monononuclear cells (PBMCs)by allogeneic stimulation, microaggregation of TCR/ CD3 complex or the costimulatory molecule CD28 with anti-CD3 mAb or anti-CD28 mAb in the presence of PMA. All of these stimuli induced MICA expression, as assessed by Western blot, RT-PCR and flow cytometry, reaching a maximum at 4 to 7 days after stimulation, depending on the stimulus. Using pharmacological inhibitors we next investigated the signal transduction pathways involved in MICA induction triggered by TCR/CD3 crosslinking or costimulation through CD28 in the presence of PMA. We found that several signaling pathways like Lck/ Fyn, ERK1/2, p38 MAPK, calcineurin, Jak and p70 56 are involved in MICA induction: By pharmacological inhibition of NF-kB, we found that MICA expression was dependent on NF-kB, most probably through a kB binding sequence located in the first intron of the MICA gene. By EMSA and supershift assays we found that this sequence bound RelA/p50 and p50/p50 NF-kB dimers present in nuclear extracts of activated T cells. Pharmacological blockade of NF-kB also inhibited MICA expression in HeLa cells and overexpression of RelA in these cells increased MICA expression, suggesting that NF-kB regulates MICA expression. Mitogenic cytokines, like IL-2 and IL-4, were able to induce MICA expression in T cells. This molecule was also induced in Th1 or Th2 polarized cells. We observed that PMA/ lonomycin stimulation induced surface MICA expression on purified CD4+ T cells, but not on CD4+ T cells present in PBMCs, more likely due to a soluble factor secreted by activated PBMCs. PMA/lonomycin activated CD4+ T cells became targets of cytotoxicity by syngeneic IL-2 activated NK cells (LAK), but not of resting NK cells. Blocking MICA-NKG2D interaction with an anti-MICA mAb, developed in our laboratory, showed that MICA plays a marginal role in this cell death. CONCLUSIONS: MICA is induced in T cells by physiological stimuli through the activation of Lck/Fyn, ERK1/2, p38 MAPK, calcineurin, Jak and p70 56 signal transduction pathways, as well as the transcription factor NF-kB. MICA expression on the surface of CD4+ T cells play a marginal role as target of cytotoxicity by activated NK cells. In this Thesis some of the signal transduction pathways and a transcription factor involved in MICA expression are described for the first time. Also, the results suggest that MICA NKG2D interaction may be a novel mechanism of regulation of the adaptive immune response.

* A este resumen le pueden faltar caracteres especiales. Consulte la versión completa en el documento en formato PDF

Registro:
Título : Inmunobiología de MICA en linfocitos T: estímulos fisiológicos, rutas de señalización y consecuencias funcionales de su expresión    
Autor : Molinero, Luciana Lorena
Director : Zwirner, Norberto Walter
Año : 2004
Editor : Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Filiación : Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Hospital de Clínicas "José de San Martín". Laboratorio de Inmunogenética
Grado obtenido : Doctor en Ciencias Biológicas
Ubicación : Preservación - http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3711_Molinero
Idioma : Español
Area Temática : Biología / Inmunología
URL al Documento : 
URL al Registro : 
hola chau _gs.DocumentHeader_ chau2 _documentheader_ chau3
Estadísticas:
     http://digital.bl.fcen.uba.ar
Biblioteca Central Dr. Luis Federico Leloir - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires
Intendente Güiraldes 2160 - Ciudad Universitaria - Pabellón II - C1428EGA - Tel. (54 11) 4789-9293 int 34